전라남도 해남의 패션프루트 재배농가에서 바이러스 병징을 나타내는 잎을 채집하여 -70°C의 초저온냉동고에서 유지하였다.

지표식물로 사용된 Nicotiana benthamiana, N. tabacum cv. Xanti nc, N. tabacum cv. Samsun, N. rustica, N. glutinosa, Chenopodium amaranticolor와 C. quinoa는 본 연구실에서 유지 중인 종자를 이용하였으며, 고추, 쥬키니호박, 오이는 시판 품종을 이용하였다. 모든 식물은 27°C, 60% 습도의 항온항습실에서 16시간의 광조건 및 8시간의 암조건으로 재배하였다.

채집된 잎은 막자사발에서 0.1 M phosphate buffer (pH 7.2)와 함께 마쇄하였다. 마쇄된 즙액은 건전 식물의 잎에 카보런덤을 얇게 뿌린 뒤 기계적으로 접종하였다.

바이러스 병징을 보이는 패션푸르트 잎 디스크 2장을 기존에 잘 알려진 phenol/chloroform 방법을 이용하여 total RNA를 추출하였다(Sambrook 등, 1989).

추출된 total RNA는 패션푸르트에 보고된 11종 바이러스의 특이 프라이머를 이용하여 RT-PCR에 사용되었다. cDNA 합성을 위해 M-MLV reverse transcriptase (Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 42°C에서 1시간 동안 역전사 반응을 진행하였으며, 이후 5분간 94°C의 변성과정을 추가하였다. 20 µl의 역전사 반응액은 5x Reaction Buffer 4 µl, 10 mM dNTP 2 µl, 바이러스별 10 pmol reverse primer 1 µl, total RNA 2 µl, M-MLV reverse transcriptase 0.5 µl 및 10 µl의 멸균수로 조제하였다. 역전사 산물은 i-taq polymerase (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)를 이용하여 초기 변성 94°C 5분 이후 변성 95°C 30초, 결합 50°C 30초, 신장 72°C 30초의 과정을 34회 반복하고, 마지막 신장 단계를 72°C 5분간 수행하였다. PCR 반응액은 10x Reaction Buffer 5 µl, 10 mM dNTP 4 µl, 바이러스별 10 pmol forward/reverse primer 각 1 µl, cDNA 2 µl, i-taq polymerase 0.5 µl 및 36.5 µl의 멸균수로 조제하였다. RT-PCR 산물은 1% agarose gel에서 전기영동하여 Gel Doc XR+ Gel Documentation System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)에서 UV로 확인하였다.

11종의 패션프루트 감염 바이러스를 검정하기 위한 바이러스별 특이 프라이머는 기존에 보고된 프라이머 서열 또는 National Center for Biotechnology Information (NCBI)에서 각 바이러스의 염기서열을 수집하여 보존된 서열을 대상으로 제작하였다(Table 1).

증폭된 PCR 산물은 pGEM-T easy vector (Promega)를 이용하여 클로닝하였다. 클로닝된 plasmid는 Macrogen (Seoul, Korea)에 의뢰하여 ABI 3730xl System을 통해 삽입된 DNA 서열을 결정하였다.

결정된 염기서열은 NCBI의 Basic Local Alignment Search Tool에서 Standard databases의 Highly similar sequences로 검색하였다.

17개의 CMV 분리주의 외피단백질 뉴클레오타이드 서열을 미국 국립생물정보센터(NCBI)로부터 확보하였으며, MEGA X프로그램의 Clustal W 툴을 통해 alignment 분석을 수행하였다. 이후 Maximum Likelihood법으로 1,000회의 bootstrap을 실시하여 계통수를 생성하였다.

정렬된 염기서열은 FASTA 파일로 변환하여 Sequence Demarcation Tool version 1.3 (SDTv1.3) 프로그램을 이용하여 pairwise alignment를 수행하였다.

2020년 7월, 전라남도 해남의 패션프루트 재배농가에서 바이러스 병징인 퇴록병반과 엽맥녹대가 보이는 패션프루트 잎 3개를 채집하였다(Fig. 1). 바이러스 동정을 위해 병징이 보이는 잎에서 추출된 total RNA를 국내 패션프루트에서 보고된 6종 및 해외에서 보고된 5종의 바이러스에 대한 특이 primer를 사용하여 RT-PCR 검정을 수행하였다(Table 1). RT-PCR 산물을 1% agarose gel에서 전기영동한 결과, 유일하게 CMV 외피단백질을 표적으로 하는 특이 primer 로 증폭된 657bp의 DNA 밴드가 확인되었다(Fig. 2). RT-PCR을 통해 얻어진 amplicon을 TA 클로닝하여 CMV 외피단백질의 염기서열을 결정하였다(Macrogen). 획득한 염기서열을 NCBI의 Basic Local Alignment Search Tool 검색 결과, 패션프루트에서 검정된 CMV는 기존 GenBank에 등록된 국내 여주에서 분리된 CMV-BGK 분리주(NCBI accession no. LC701732)와 99.09%의 상동성을 보였으며, 이를 CMV-HN2 (NCBI accession no. LC654689)로 명명하였다.

패션프루트에서 확인된 CMV의 생물학 적 특성을 확인하기 위해 CMV의 감염이 확인된 패션프루트 잎을 담배 5종(N. benthamiana, N. tabacum cv. Xanti nc, N. tabacum cv. Samsun, N. rustica, N. glutinosa), 명아주 2종(C. amaranticolor, C. quinoa), 고추(Capsicum annuum cv. Cheongyang), 쥬키니호박(Cucurbita pepo cv. Jeongilpum) 그리고 오이(Cucumis sativus cv. Daeseon)에 즙액 접종하였다. 지표식물에서 CMV-HN2는 담배 5종, 고추, 쥬키니호박 그리고 오이의 상엽에서 모자이크를 보이며 전신감염하였고, 명아주 2종에서는 접종엽에 국소 괴사 반점을 나타냈으며, 이러한 CMV-HN2의 지표식물 반응은 대조구로 사용된 CMV의 대표적인 분리주인 CMV-Fny와 유사하였으며, 전형적인 CMV의 병징을 나타냈다(Table 2). 따라서 패션프루트에 감염하는 CMV가 일반적인 CMV 분리주와 마찬가지로 다양한 기주식물에 감염할 수 있다는 것을 시사한다.

다양한 CMV 분리주와 패션프루트에서 분리된 8개의 CMV 분리주가 아미노산 수준에서 계통 분석이 수행되었다(MEGA X software). 보고된 패션프루트 분리주들은 subgroup I에 속하는 것을 확인할 수 있었으며, 그중 CMV-HN2는 subgroup IA에 속하는 것으로 나타났다(Fig. 3). Subgroup IA에 속한 패션프루트 분리주들은 나이지리아와 국내에서 분리되었으며, subgroup IB에 속한 패션프루트 분리주들은 중국, 일본, 국내 예천지역에서 분리되어 subgroup IB의 아시아에 제한된 분포와 일치하였다 (Fig. 3). 또한 중국과 일본의 패션프루트에서 분리된 CMV 분리주들은 하나의 클러스터를 형성하였다. 각 서브그룹에 속하는 패션프루트에서 분리된 CMV와 CMV-HN2의 정확한 외피단백질 서열 차이를 확인하기 위해 뉴클레오타이드와 아미노산 수준에서 각각 비교 분석하였다. 뉴클레오타이드 수준에서 패션프루트 분리주 간에 pairwise alignment (SDTv1.3 software)를 수행한 결과, CMV-HN2는 약 92%에서 97% 수준의 염기서열 상동성을 나타냈다(Fig. 4A). 서브그룹 간 염기서열 상동성은 92%에서 94% 수준이었으며, 국내 예천지역의 패션프루트 분리주 CMV (CMV-Yecheon)와 CMV-HN2 또한 93% 수준의 염기서열 상동성을 보였다. 아미노산 수준에서 CMV-HN2는 패션프루트에서 분리된 CMV 분리주(CMV-GX1, CMV-GZ, CMV-HN1, CMV-JDGYYX, CMV-JDGYXSBN 및 CMV-KoPF)와 4-8개의 아미노산 차이로 96%에서 98% 수준의 염기서열 상동성을 보였다(Fig. 4B). 이러한 결과는 세계적인 패션프루트 분리주들 간의 외피단백질이 유전적 다양성이 존재하며, 국내 패션프루트 분리주 CMV 사이에도 유전적 차이가 있음을 보여준다. 본 연구는 국내 패션프루트의 주요 병원성 바이러스인 CMV를 분리하여 생물학적, 분자적 특성을 확인해 향후 국내 패션푸르트 감염 바이러스 연구를 위한 기초 자료로 활용될 것으로 사료된다.