*Corresponding author 서 론
대추나무(Ziziphus jujuba)는 갈매나무과(Rhamnaceae) 대추나무속에 속하는 낙엽활엽교목이며, 우리나라, 중국, 일본 등에서 재배되고 있다. 산림청의 ‘2021 임산물생산조사’에 따르면(Korea Forest Service, 2022), 대추는 국내 생산량이 7,895톤, 생산액은 787억 원으로 조사되어 떫은감, 밤과 함께 경제적으로 중요한 수실류 중 하나로 알려져 있다.
전 세계적으로 대추나무에서는 균류와 파이토플라스마에 의한 30여 종의 다양한 병이 알려져 있으며(Mirzaee, 2014), 국내에서는 16종이 보고되어 있다(The Korean Society of Plant Pathology, 2022). 한편 대추나무에서는 황화, 뒤틀림, 기형, 생육 불량 등 다양한 이상증상이 발생하고 있지만, 이와 관련한 바이러스병에 관한 연구는 매우 미흡한 실정이다. 최근 대추나무는 중국에서 reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) 진단 및 전사체 분석을 통하여 4종의 병원체, hop stunt viroid (HSVd, Hop stunt viroid), jujube associated badnavirus (JuBV), jujube mosaic-associated virus (JuMaV, Badnavirus tesselloziziphi), jujube yellow mottle-associated virus (JYMaV, Emaravirus ziziphi)가 보고되었다(Du 등, 2017; Guo 등, 2021; Liu 등, 2022; Yang 등, 2019a; Zhang 등, 2009). 국내에서는 대추나무에서 바이러스병의 전체적인 감염실태에 대해서는 알려진 바 없으나, 최근 JYMaV가 보고되었다(Choi 등, 2023).
본 연구에서는 대추나무에 감염된 바이러스 및 바이로이드를 탐색하기 위하여 메타전사체 분석을 활용하였다. 최근 다양한 다년생 식물에서 메타전사체 분석으로 많은 신종과 변종 바이러스가 검출되고 있으며(Bang 등, 2022; Cho 등, 2016; Coetzee 등, 2010; Igori, 2017; Jo 등, 2018; Kim 등, 2021, 2022b; Lim 등, 2016; Rwahnih 등, 2009; Yang 등, 2019b), 또한 매우 많은 바이러스가 복합감염된 것이 확인되고 있다(Kim 등, 2022a; Kreuze 등, 2009). 대추에서는 최근 연구된 다년생 과수의 바이러스 감염양상과는 다르게 4종의 병원체만 알려져 있으므로, 알려진 병원체의 진단만으로는 전체적인 바이러스병의 감염실태를 파악하기는 불충분하다고 판단되었다. 그리하여 본 연구에서는 대추나무에 발생하는 다양한 이상증상의 원인을 구명하기 위하여 다양한 품종과 농가 시료를 대상으로 메타전사체 분석을 수행하여 신종 및 변종 바이러스를 탐색하고, 이를 바탕으로 RT-PCR 진단을 실시하여 바이러스병의 종류와 감염실태를 조사하고자 하였다. 이를 통하여 국내 대추나무 바이러스 무병묘 육성과 나아가 생산량 및 품질향상을 위한 기초자료로 활용하고자 하였다.
재료 및 방법
대추나무 시료 채집
대추나무에서 바이러스의 감염실태를 조사하기 위하여 황화, 노란색 반점, 모자이크, 엽맥 황화, 총생, 잎 말림, 뒤틀림, 과실 기형, 생육 불량 등과 같은 이상증상(Fig. 1)을 나타내는 잎과 과실 시료 61점을 아래와 같이 채집하였다. 2019년 8월에 수원 국립산림과학원 산림생명자원연구부 시험포장에서 6개(‘금성’, ‘대리대추’, ‘무등’, ‘보은대추’, ‘복조’, ‘월출’) 품종에서 49점의 시료를 채집하였다. ‘보은대추’와 ‘복조’품종은 국내 재래종이고, ‘금성’, ‘무등’, ‘월출’은 국내 육성품종이며, ‘대리대추’는 중국 도입종이다(Nam, 2016). 그리고 농가포장을 대상으로 2019년 8월에 영천과 경산에서 6점을 채집하였으며, 2021년 8월에 대구, 평택, 영천에서 6점의 시료를 채집하였다.
Fig. 1.
Viral symptoms in various cultivars of Ziziphus jujuba. The red box indicates viral symptoms on two jujube cultivars infected with the three viruses, jujube associated badnavirus (JuBV), jujube mosaic-associated virus (JuMaV) and jujube yellow mottle-associated virus (JYMaV). The blue box indicates viral symptoms on five jujube cultivars infected with the two viruses, JuBV and JYMaV. The yellow box indicate viral symptoms on jujube unknown cultivar infected with the single virus, JuBV. Samples A−X are collected from Suwon (2019), Y is from Yeongcheon (2019), Z is from Gyeongsan (2019), and AA and BB are from Yeongcheon (2021). (A−D) Dalizao. (E−H) Geumseong. (I−L) Mudeung. (M−P) Boeun. (Q−T) Bokjo. (U−X) Wolchul. (Y−BB) Unknown.
대추나무 메타전사체 분석
대추나무에 감염된 바이러스를 탐색하기 위하여 2019년 시험포장에서 채집한 다양한 이상증상을 나타내는 시료 49점과 농가포장에서 채집한 6점의 시료를 이용하여 메타전사체 분석을 수행하였다. 대추나무 잎 시료 55점을 각각 약 10 mg씩 채취하여 하나로 모은 후(pooling), 유발·유봉과 액체질소를 이용하여 마쇄하였다. 집단화한 시료에서 RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 제조사에서 권장한 방법대로 전체 RNA를 추출하였다. 추출한 전체 RNA는 Macrogen (Seoul, Korea)에 의뢰하여 next-generation sequencing (NGS) 분석을 실시하였다. HiSeq 4000 Sequencer (Illumina, San Diego, CA, USA) 장비를 이용하여 100 bp paired-end sequencing 분석으로 미가공 데이터(raw-data)를 생산하였다. Trinity (version trinityrnaseq_r20140717, bowtie 1.1.2) 프로그램의 de novo transcriptome assembly 를 통하여 생산된 데이터로부터 컨티그(contig)를 조립하였다. DIAMOND (version 0.9.21) 프로그램의 공공 생물정보 데이터베이스(Gene ontology [version v20180319], UniProt [version 20180116], NCBI non-redundant protein [version 20180503], Pfam [version 20160316], EggNOG [version eggnog4], NCBI nucleotide [verision 20180116], Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes [version 20190104])를 기반으로 한 NCBI BLASTn 및 BLASTx 분석(E-value 기준값: 1.0E-5)으로 조립된 컨티그들에서 바이러스와 관련된 컨티그들을 확보하였다. 최종선발된 식물바이러스 관련 컨티그들을 Lee 등(2020a)과 Bak 등(2022)이 수행한 방법으로 해당 바이러스에서의 위치와 상동성 정도를 그림으로 나타내었다(Fig. 2).
Fig. 2.
Schematic overview of the alignment of contigs with NCBI reference sequences using BLASTn. The colored arrows indicate how well the position of each contig matches the NCBI reported sequence. (A) Jujube associated badnavirus. (B) Jujube mosaic-associated virus (Badnavirus tesselloziziphi). (C) Jujube yellow mottle-associated virus (Emaravirus ziziphi).
RT-PCR 및 PCR 진단
RT-PCR 및 PCR 진단대상은 메타전사체 분석으로 검출된 JuBV, JuMaV 및 JYMaV와 중국에서 기 보고된 HSVd (Zhang 등, 2009)를 포함하였다. 메타전사체 분석으로 검출된 컨티그와 기보고된 바이러스의 염기서열 정보 를 이용하여 3종의 바이러스에 대한 진단용 프라이머를 설계하였다(Table 1). JuBV, JuMaV 및 JYMaV 진단용 프라이머는 2쌍씩 설계되었으며, HSVd는 기보고된 프라이머(Kofalvi 등, 1997) 서열을 이용하였다. 이를 이용하여 61점의 개별시료에 대하여 RT-PCR 및 PCR 진단하여 감염실태를 조사하였다. 61점의 개별시료에서 WizPrep Plant RNA Mini Kit (Wizbioso-lutions, Seongnam, Korea)를 이용하여 제조사의 권장방법으로 전체 RNA를 추출하였다. RT-PCR 진단을 위한 반응액을 SuPrimeScript RT-PCR Premix (GeNet Bio, Daejeon, Korea) 10 μ l, 전체 RNA 1 μ l, 정방향 및 역방향 프라이머 각 1 μ l (10 pmol/μ l), 그리고 증류수 7 μ l를 혼합하여 20 μ l로 조제하였다. 조제한 반응액을 역전사(RT) 과정으로 50 ° C에서 30분 및 95 ° C에서 2분간 처리하였으며, PCR 과정으로 95 ° C에서 30초, 55 ° C에서 30초, 72 ° C에서 1분을 35회 반복하고 72 ° C에서 5분 동안 처리하였다. 전기영동은 0.5× TAE 완충액, 1.5% 아가로스 겔 및 1 kb Plus DNA Ladder (BIOFACT, Daejeon, Korea)를 사용하였다. RT-PCR 증폭 산물은 135 V 40분간 전기영동 후, gel documentation system을 이용하여 반응산물을 확인하였다. PCR 진단을 위한 반응액은 EzPCR HS 5× Master Mix (ELPIS-BIOTECH, Daejeon, Korea) 4 μ l, 전체 RNA 1 μ l, 정방향 및 역방향 프라이머 각 1 μ l (10 pmol/μ l), 증류수 13 μ l 혼합하여 20 μ l로 조제하였다. 조제한 반응액을 초기 변성 과정으로 94 ° C에서 5분 동안 처리하였으며, PCR 증폭 과정으로 95 ° C에서 30초, 55 ° C에서 30초, 72 ° C에서 1분을 35회 반복하고 72 ° C에서 5분 동안 처리하였다. 이후 전기영동으로 PCR 반응산물을 확인하였다.
Table 1.
| Virus | Primer | Oligonucleotide sequence (5′ → 3′) | Location | Amplificon size (bp) |
|---|---|---|---|---|
| JuBV | JuBV-P3-F1433 | CGCCCCCACTTTTGATCCTTC | 1,433−1,453 | 416 |
| JuBV-P3-R1848 | CAGCCATTGTTTTTGTTGTTGCTGC | 1,824−1,848 | ||
| JuBV-P3-F5586 | GATGACTCTGTTAGTGAACAG | 5,586−5,606 | 842 | |
| JuBV-P3-R6427 | CTCTAGGTGATTGAACACACG | 6,407−6,427 | ||
| JuMaV | JuMaV-MP-F1079 | CGACCACCAGCAGTCCTACCACG | 1,079−1,101 | 589 |
| JuMaV-MP-R1667 | CAACCCAGTTAGCAAAATCATTG | 1,645−1,667 | ||
| JuMaV-MP-F1079 | CGACCACCAGCAGTCCTACCACG | 1,079−1,101 | 744 | |
| JuMaV-MP-R1822 | GCCATTGCTAGCCAAATAGTCAG | 1,800−1,822 | ||
| JYMaV | JYMaV-Rd1-F240 | GGTGGTACCTCACTGAATGG | 240−259 | 877 |
| JYMaV-Rd1-R1116 | CTGTATATCATCTATCTGGATGC | 1,094−1,116 | ||
| JYMaV-C3-F362 | ACCAAGTTGGTCAGTTCTCTC | 362−382 | 678 | |
| JYMaV-C3-R1039 | GGTCTTAAAGCTGTTGAACCAG | 1,018−1,039 | ||
| HSVd c | Vp20 | CGCCCGGGGCAACTCTTCTCAGAATCC | 79−103 | 297 |
| Vp19 | GCCCCGGGGCTCCTTTCTCAGGTAAG | 61−86 |
a JuBV, jujube associated badnavirus; JuMaV, jujube mosaic-associated virus; JYMaV, jujube yellow mottle-associated virus; HSVd, hop stunt viroid.
b Primers were designed based on contigs detected by metatranscriptome analysis and sequences reported in the NCBI databases listed below. JuBV: MN274946 and OL739567; JuMaV: KX852476, MW892537 and OL739568; JYMaV segment RNA1: MK305894, MT953011, MT953018 and MT953024; JYMaV segment RNA3: MK305896, MT953026, MT975910, MT975911, MT975912, MT975913, MT975914, and MT975915.
바이러스 염기서열 분석
RT-PCR 및 PCR 진단으로 검출된 JuBV, JuMaV 및 JYMaV을 검증하기 위하여 PCR 산물에 대한 염기서열 분석을 실시하였다. JuBV와 JYMaV는 대추 6개 품종에서 1점의 시료를 선정하여 염기서열을 분석하였으며, JuMaV 는 바이러스가 검출된 ‘금성’과 ‘대리대추’ 각 1점의 시료에서 염기서열 분석을 실시하였다. (RT)PCR 산물은 Expin Combo GP (GeneAll, Seoul, Korea)를 이용하여 제조사의 권장방법으로 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 All in One PCR Cloning Kit (BIOFACT)를 사용하여 클로닝하였으며, universal primer (M13-47F 와 M13-48R)를 이용한 PCR로 PCR 산물의 삽입 여부를 확인하였다. 플라스미드의 재조합이 확인된 균주에서 DNA-spin Plas-mid DNA Purification Kit (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)를 이용하여 제조사의 권장방법으로 플라스미드를 추출하였다. 추출한 플라스미드를 Bioneer (Daejeon, Korea)에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다. 최종적으로 JuBV 6개 분리주, JuMaV 2개 분리주 및 JYMaV 6개 분리주의 염기서열을 결정하였으며, NCBI BLASTn을 이용하여 상동성과 유연관계를 분석하였다.
결 과
메타전사체 분석
대추나무에 감염된 바이러스를 탐색하기 위하여 대추나무 시료 55점을 집단화한 후, 메타전사체 분석을 통하여 약 40 Gbp (총 리드 수: 406,458,318개)의 데이터를 생산하였다. Trinity 프로그램의 de novo transcriptome as-sembly를 이용하여 생산된 데이터로부터 95,071개(리드 수: 311,778,276개)의 컨티그를 조립하였다. 이들 중에서 바이러스 관련 컨티그를 선발하기 위하여 DIAMOND 프로그램으로 공공생물정보 데이터베이스를 기반으로 한 BLASTn 및 BLASTx 분석을 수행하였으며, 결과적으로 바이러스 관련 컨티그 5,011개(리드 수: 19,323,336개)를 확보하였다. 일차적으로 확보된 컨티그는 개별적인 NCBI BLASTn 및 BLASTx 분석을 수행하여 최종적으로 51개(리드 수: 511,750개)의 식물바이러스 관련 컨티그를 선발하였다(Supplementary Table 1). 대추나무 시료의 메타전사체 분석으로 최종적으로 선발한 51개의 컨티그는 3종의 식물바이러스(JuBV, JuMaV 및 JYMaV)와 관련된 것으로 확인되었다. 각각의 컨티그는 기보고된 3종 바이러스의 염기서열을 바탕으로 컨티그의 게놈상의 위치와 상동성을 Fig. 2에 도식하였다.
JuBV와 관련된 컨티그는 23개(리드 수: 6,485개)가 검출되었다. 컨티그의 길이는 202-4,571 bp 범위이며, JuBV HZ/WS 분리주(accession no. OL739567)와 75.8-100%의 염기서열 상동성을 나타내었다. JuMaV와 관련된 컨티그는 14개(리드 수: 218개)가 검출되었다. 해당 컨티그의 길이는 202-557 bp 범위이며, JuMaV Z6 분리주(KX852476)와 69.6-100%의 염기서열 상동성을 나타내었다. JYMaV와 관련된 컨티그는 14개(리드 수: 505,047개)가 검출되었다. 컨티그의 길이는 217-7,194 bp 범위이며, JYMaV 분리주 JYMaV1 (RNA1: MK305894, RNA2: MK305895, RNA3: MK305896, RNA4: MK305897, RNA5: MK305898, RNA6: MK305899)와 85.7-96.9% 염기서열 상동성을 나타내었다.
대추나무 바이러스 감염실태
국내 대추나무의 바이러스 감염실태를 조사하기 위하여 채집한 시료 61점에 대하여 RT-PCR 진단을 실시하였다. 진단대상 병원체는 메타전사체 분석으로 검출된 JuBV, JuMaV 및 JYMaV와 중국에서 기보고된 HSVd를 포함하여 4종이며, 각각의 종에 대한 특이적 프라이머를 사용하였다(Table 1). 또한 검출된 DNA 바이러스(JuBV와 JuMaV)의 확인과 RT-PCR 진단 결과의 신뢰성을 확보하기 위하여 PCR 진단을 함께 수행하였다. 대추나무 시료에 대한 RT-PCR 및 PCR 진단 결과는 아래와 같다(Table 2).
Table 2.
The infection rates (%) of three viruses and one viroid in Ziziphus jujuba using RT-PCR and PCR assay a
| Location | Cultivar | No. of samples | JuBV | JuMaV | JYMaV | HSVd | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| RT-PCR | PCR | RT-PCR | PCR | RT-PCR | PCR | RT-PCR | PCR | |||
| Suwon | Boeun | 04 | 04 | 04 | -b | - | 04 | - | - | - |
| Bokjo | 19 | 19 | 19 | - | - | 19 | - | - | - | |
| Dalizao | 04 | 04 | 04 | 4 | 4 | 04 | - | - | - | |
| Geumseong | 07 | 07 | 07 | 1 | 1 | 07 | - | - | - | |
| Mudeung | 07 | 07 | 07 | - | - | 07 | - | - | - | |
| Wolchul | 08 | 08 | 08 | - | - | 08 | - | - | - | |
| Daegu | Unknown | 02 | 02 | 02 | - | - | - | - | - | - |
| Gyeongsan | Unknown | 05 | 05 | 05 | - | - | 05 | - | - | - |
| Pyeongtaek | Unknown | 01 | 01 | 01 | - | - | - | - | - | - |
| Yeongcheon | Unknown | 04 | 04 | 04 | - | - | 01 | - | - | - |
| Total (infection rate, %) | 61 | 61(100) | 61(100) | 5(8.2) | 5(8.2) | 55(90.2) | 0(0) | 0(0) | 0(0) | |
대추나무 시료 61점은 품종과 포장에 관계없이 모두 1종 이상의 바이러스에 감염되어 있었다. 대추나무 시료의 바이러스별 감염률은 JuBV 100% (61/61점), JuMaV 8.2% (5/61점), JYMaV 90.2% (55/61점)을 나타내었다. 한편 메타전사체 분석에서 발견되지 않은 HSVd는 RT-PCR 진단에서도 검출되지 않았다.
대추나무 품종별 바이러스 감염양상은 다음과 같았다. 4개 품종(‘무등’, ‘보은대추’, ‘복조’, ‘월출’) 38점 모든 시료는 JuBV+JYMaV에 감염되어 있었다. ‘금성’ 7점의 시료는 JuBV+JYMaV에 6점이 감염되었으며, JuBV+JYMaV+JuMaV에 1점이 감염되어 있었다. ‘대리대추’ 품종은 4점의 시료 모두가 JuBV+JYMaV+JuMaV에 감염되어 있었다. 특별히 JuMaV는 중국 도입종인 ‘대리대추’ 품종 모든 시료와 ‘금성’ 시료 1점에서만 검출되었으며, 나머지 국내 재래종, 육성품종과 농가 포장 시료 12점에서는 검출되지 않았다.
대추나무 시료 채집 포장별 바이러스 감염양상은 다음과 같이 나타났다. 수원 소재 국립산림과학원 시험포장에서는 3종의 바이러스가 검출되었으며, 4개 지역 농가포장에서는 2종의 바이러스만 검출되었다. JuBV는 채집 포장과 품종에 관계없이 모든 시료에서 검출되었다. JuMaV는 시험포장의 중국 도입종인 ‘대리대추’와 국내 육성품종인 ‘금성’에서만 검출되었으며, 농가포장에서는 검출되지 않았다. JYMaV는 시험포장에서 채집한 49점 모든 시료에서 검출되었으나, 농가포장 12점 시료 중에서는 6점(50%)의 시료에서만 검출되었다. 바이러스 복합감염 정도를 볼 때, 수원 소재 시험포장에서는 2종 이상의 바이러스에 모두 복합감염되어 있는 반면, 농가포장에서는 50%의 시료만 JuBV와 JYMaV에 복합감염되어 있었다. 한편 포장 단위로 채집된 시료의 바이러스 감염양상은 ‘금성’품종 1점의 시료를 제외한 60점의 시료가 채집 포장별로 동일하였다.
61점 대추나무 시료의 바이러스별 감염조합은 3가지(JuBV, JuBV+JYMaV, JuBV+JYMaV+JuMaV) 형태로 나타났다. 세부적으로는 JuBV 단독감염이 9.8% (6/61점), JuBV+JYMaV 2종 복합감염이 82.0% (50/61점), 그리고 JuBV+JYMaV+JuMaV 3종 복합감염이 8.2% (5/61점)으로 나타났다(Table 3). JuBV 단독감염은 농가시료 6점에서, JuBV+JYMaV 2종 복합감염은 시험포장의 4개 품종(‘무등’, ‘보은대추’, ‘복조’, ‘월출’) 모든 시료와 농가시료 6점에서, JuBV+JYMaV+JuMaV 3종 복합감염은 ‘대리대추’품종 4점의 시료와 ‘금성’ 품종 1점의 시료에서 확인되었다.
Table 3.
The incidence rate of viral infection types in Ziziphus jujuba by cultivars a
대추나무 바이러스 병징
국내 대추나무에 감염된 모든 바이러스를 확보하기 위하여 다양한 품종이 재배되고 있는 국립산림과학원 시험포장과 4개 지역 농가포장에서 다양한 이상증상 시료를 채집하였다. 대추나무 시험포장과 농가포장에서는 황화, 노란색 반점, 모자이크, 잎 말림, 잎 뒤틀림, 총생, 과실 기형, 생육 부진 등의 다양한 이상 증상을 대부분의 대추나무에서 관찰할 수 있었다(Fig. 1). 이러한 이상증상 시료 61점을 분석한 결과, 모든 시료는 1종 이상의 바이러스에 감염된 것으로 확인되었다. 이러한 결과로 볼 때, 대추나무에 나타나는 다양한 이상증상의 원인은 바이러스 감염에 의한 병징으로 추정할 수 있다. 중국에서 보고된 기존 연구에 따르면, JuMaV는 모자이크, 뒤틀림(Du 등, 2017)을, JuBV는 모자이크, 뒤틀림, 과실 착색불량(Liu 등, 2022)을, JYMaV는 모틀, 황화, 뒤틀림, 노란색 반점, 과실 기형, 얼룩(Guo 등, 2021; Yang 등, 2019a)을 일으키는 것으로 알려졌다. 국내 대추나무 시험포장 및 농가포장에서 나타난 증상 또한 기보고된 바이러스 병징과 거의 유사한 것으로 판단된다. Fig. 1에서는 대추나무 품종 및 포장별로 채집된 시료 의 다양한 병징을 보여주고 있다. 전체적으로 볼 때, 대추나무 품종별로 나타나는 증상은 어느 정도 유사성을 나타내는 것으로 관찰되며, 이러한 결과는 RT-PCR 진단에서 바이러스 감염양상이 매우 비슷하다는 점과 부합되는 것으로 판단된다. 일반적으로 다수의 바이러스에 복합감염될수록 병징이 심해지는 경향이 있는데, 본 연구에서 대추나무에 나타나는 병징 또한 단독감염, 2종 복합감염, 3종 복합감염에 따라 병징의 정도가 강하게 나타났다. 채집된 61점 모든 시료가 3종 바이러스에 단독 및 복합감염되어 있다는 점에서 대추나무에 나타나는 다양한 이상증상은 바이러스 감염이 그 원인인 것으로 판단된다.
대추나무 검출 바이러스의 검증 및 상동성 분석
메타전사체 분석 및 RT-PCR 진단으로 검출된 바이러스를 검증하기 위하여 JuBV 6개 분리주, JuMaV 2개 분리주, 그리고 JYMaV 6개 분리주의 전체 또는 부분 염기서열을 결정하였다.
JuBV는 61점 모든 시료에서 검출되었으며, 본 연구에서는 품종별로 1개의 시료를 선정하여 6개 분리주의 전체 염기서열을 결정하고 GenBank에 등록하였다. 전체 염기서열을 결정한 JuBV 분리주는 대추 품종과 시료번호를 감안하여 ‘ Boeun01’ (LC739271), ‘ Bokjo27’ (LC739272), ‘ Dalizao33’ (LC739273), ‘ Geumseong12’ (LC739274), ‘ Mudeung05’ (LC739275), ‘ Wol-chul19’ (LC739276)로 각각 명명하였다. 본 논문에서는 JuBV RT-PCR 산물(416 bp)에 대한 염기서열 분석 결과만 기술하고자 하며, 전체 염기서열에 대한 분석 내용은 추후 다른 논문으로 작성하고자 한다. 품종별로 분석한 6개 JuBV 분리주의 RT-PCR 산물은 중국에서 기보고된 2개 분리주(HZ/WS 분리주: OL739567, BJ 계통: MN274946)와 100% 염기서열 상동성을 나타내었다.
JuMaV는 2개 품종(‘금성’, ‘대리대추’) 5점의 시료에서 검출되었다. ‘금성’과 ‘대리대추’ 품종에서 각 1점의 시료를 선정하여 JuMaV RT-PCR 산물(589 bp)에 대하여 염기서열을 결정하고 Genbank에 등록하였다(Geumseong15: LC769348, Dalizao33: LC769349). 분석한 RT-PCR 산물 염기서열은 중국에서 기보고된 Z6 분리주(KX852476)와 99.5-99.8%의 뉴클레오타이드 상동성을 나타냈었다.
JYMaV는 채집한 6개 품종 모든 시료와 농가시료 6점에서 검출되었으며, 품종별로 1점의 시료를 선정하고, JYMaV RNA 3의 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 유전자에 대하여 전체 염기서열(876 bp, 885 bp)을 결정하여 GenBank에 등록하였다(Boeun2: LC754200, Bokjo28: LC754201, Dalizao34: LC754198, Geumseong13: LC754197, Mudeung6: LC754199, Wolchul20: LC754202). 검출된 JYMaV의 검증을 위하여 6 분리주의 RT-PCR 산물(678 bp)에 대한 염기서열을 결정하였다. 결정한 뉴클레오캡시드 유전자 부분 염기서열은 중국에서 보고된 JYMaV1 분리주(MK305896)와 95.7-96.3%의 뉴클레오타이드 상동성을 나타냈었다. 위에서 언급한 바와 같이 대추나무에서 검출된 3종의 바이러스는 전체 및 부분 염기서열 분석결과 모두 각각의 바이러스로 확인되었다.
고 찰
본 연구에서는 우리나라 대추나무에 발생하는 바이러스를 탐색하고, 그 감염실태를 구명하기 위하여 메타전사체 분석 및 RT-PCR 진단을 수행하였다. 국내 대추나무에 발생하는 모든 바이러스를 채집하기 위하여 국립산림과학원 시험포장에서 6개(‘금성’, ‘대리대추’, ‘무등’, ‘보은대추’, ‘복조’, ‘월출’) 품종과 4개 지역 농가포장에서 다양한 이상증상을 나타내는 시료 61점을 채집하였다. 산림청(2015)의 ‘2014 임산물 생산비 통계’에 따르면(Korea Forest Service, 2015), 우리나라에서 재배되고 있는 대추나무 품종은 ‘복조’ 77.7%, ‘보은’ 5.4%, ‘무등’ 3.7%, 그리고 기타 품종이 13.2%로 조사되는 것으로 보아, 본 연구에서 바이러스 탐색을 위한 시료의 다양성은 충분히 확보된 것으로 판단된다. 이들 시료의 NGS로 생산한 약 40 Gbp의 데이터를 분석한 결과, 2종의 DNA 바이러스(JuBV와 JuMaV)와 1종의 RNA 바이러스(JYMaV)를 검출할 수 있었다. 또한 메타전사체 분석으로 검출한 3종의 바이러스와 중국에서 기보고된 HSVd (Zhang 등, 2009)에 대한 RT-PCR 진단을 수행한 결과, 메타전사체 분석으로 검출된 3종의 바이러스만 검출되었다. 그리고 JYMaV는 6개의 genomic RNA를 가지고 있는 바이러스인데, 메타전사체 분석에서 JYMaV RNA 6개에 대한 모든 컨티그가 검출되는 것으로 볼 때(Fig. 2), 채집된 시료에 존재하는 모든 바이러스의 탐색이 효과적으로 이루어진 것으로 판단된다.
대추나무 이상증상 시료 61점에 대하여 RT-PCR 진단을 수행한 결과, 모든 시료가 1종 이상의 바이러스에 감염된 것으로 확 인되었다. 시험포장 및 농가포장 대추나무는 대부분 바이러스 병징과 유사한 이상증상을 나타내고 있었는데, RT-PCR 진단 결과로 볼 때 대추나무 이상증상의 원인은 본 연구에서 검출된 3종의 바이러스의 단독 및 복합감염으로 인한 결과로 판단할 수 있다. 시험포장과 농가포장에서 대부분의 대추나무에서는 노란색 반점, 잎 뒤틀림, 황화, 기형, 생육불량 등의 병징을 나타내고 있었는데, 이러한 대추나무 이상증상은 중국에서 보고한 바이러스의 병징과 거의 유사한 것으로 보여진다(Du 등, 2017; Guo 등, 2021; Liu 등, 2022; Yang 등, 2019a).
최근 메타전사체 분석과 RT-PCR 진단으로 주요 다년생 과수(사과, 복숭아, 포도)의 바이러스 감염양상을 조사한 결과(Bak 등, 2017; Cho 등, 2016; Igori, 2017), 대부분의 과수는 다양한 바이러스에 모두 감염되어 있는 것으로 확인되고 있다. 이러한 결과는 바이러스에 감염된 모주로부터 생산한 묘목이 그 원인으로 알려져 있다. 본 연구에서 대추나무의 바이러스 감염률이 품종과 포장에 관계없이 100%인 것으로 보아, 다른 과수와 마찬가지로 감염된 모주로부터 바이러스 무병화 과정을 거치지 않고 생산한 묘목이 그 원인일 것으로 판단된다.
대추나무 6개 품종이 재배되고 있는 시험포장과 4개 지역 농가포장의 바이러스 감염양상을 보면, 3종(JuBV, JuMaV, JYMaV)의 바이러스가 단독 또는 복합감염되어 있었다. JuBV는 시험포장 및 농가포장 시료 61점 모든 시료에서 검출되는 것으로 볼 때, 대추나무에서 가장 널리 분포하는 것으로 판단되며, 강한 병원성을 가지지는 않는 것으로 추측된다. 한편 JYMaV는 6개 품종이 채집된 시험포장에서는 모두 감염되어 있었지만, 농가포장에서 채집된 시료의 50%에서만 검출되었다. 국내 사과나무의 경우, 5종의 병원체(apple chlorotic leaf spot virus [ACLSV], apple mosaic virus [ApMV], apple stem grooving virus [ASGV], apple stem pitting virus [ASPV], apple scar skin viroid [ASSVd])에 대하여 종자산업법에서 관리되고 있다. 그러나 농가포장에서는 아쉽게도 대부분의 사과나무가 이들 바이러스에 단독 또는 복합감염되어 있다. 그 감염양상을 보면 사과에서 고병원성을 나타내며, 병징이 상대적으로 뚜렷한 ApMV와 ASSVd는 ACLSV, ASGV, ASPV와 ASSVd에 비해 감염률이 낮은 것이 특징이다(Lee 등, 2020b). 이는 관행적인 묘목 생산 과정에서 어느 정도 제거가 되기 때문으로 추정된다. 이런 점에서 농가포장 일부에서만 검출된 JYMaV는 사과나무의 고병원성 바이러스와 유사한 감염양상을 보여주는 것으로 판단되며, 또한 JYMaV의 매개체가 밝혀진다면 효과적인 방제가 가능할 것으로 판단된다.
본 연구에서 JuMaV는 61점의 시료 중에서 시험포장에서 채집한 ‘대리대추’ 4점의 모든 시료에서와 인근한 ‘금성’ 품종 7점 중에서 1점의 시료에서만 검출되었다. 그리고 RT-PCR 산물의 염기서열 분석결과 중국에서 보도된 분리주와 99% 이상의 매우 높은 상동성을 나타내는 것으로 판단할 때, 중국 도입품종인 대리대추’를 통하여 국내 유입된 것으로 추정된다. JuMaV는 본 연구에서 JuBV+JYMaV+JuMaV 3종 복합감염 형태로 검출되었으며, 검출된 대추나무는 다른 감염조합에 비하여 상대적으로 뚜렷한 바이러스 병징을 나타내었다. 그러나 다행히도 대부분의 국내 재래종, 육성품종과 농가포장 시료에서 JuMaV는 검출되지 않았다. 이러한 점에서 볼 때, 대추나무에서 JuMaV의 국내 확산은 거의 이루어지지 않은 것으로 판단된다. 대추나무에서 검출된 JuBV와 JuMaV의 매개체는 아직 밝혀지지 않았으나, 두 바이러스가 속하는 Badnavirus속 바이러스에서 진딧물과 깍지벌레류의 충매전염은 보고되어 있다(Bhat 등, 2016). 대추나무에서 JuMaV의 확산방지와 묘목 무병화를 위하여 자연상태에서의 전염양식 규명과 무병묘 검정이 신속히 수행되어야 할 것으로 판단된다.
본 연구를 통하여 국내 대추나무에 발생하고 있는 바이러스의 종류와 감염실태를 구명하였다. 또한 국내 대추나무에 JuBV 와 JuMaV는 첫 보고이며, 다양한 이상증상의 원인이 3종 바이러스의 감염으로 인한 결과로 판단할 수 있었다. 본 연구 결과는 국내 주요 산림자원식물인 대추나무의 안정적 생산과 품질 향상에 기여할 수 있는 기초자료로 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
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