2018년 6월-8월에 경상북도 영천시 신령면의 사과 재배농가(N36.01169, E129.02539)에서 사과(후지품종) 과실이 썩어서 마르고 미이라화(mummified) 되어 있으며, 과실 주변의 잎들이 시들면서 갈변한 것을 발견하였다(Fig. 1A). 과실에 병징이 생기기 시작하여 2-3주 사이에 급격하게 미이라화 되었는데 크기가 3 cm 안팎의 유과였다(Fig. 1A-C). 미이라로 된 유과 아래쪽의 과실에서 자줏빛을 띄는 검은점(pimplelike)이 형성된 것을 발견할 수 있었다(Fig. 1D). 점의 크기는 0.1-1.0 mm 직경이었다(Fig. 1E). 이러한 병징을 사과나무에서 제거하지 않고 그대로 관찰하였는데 급격하게 커지지는 않았다. 또한 배꼽부위가 검게 썩어 들어가는 과일도 발견되었다(Fig. 1F). 다양한 병징의 과실을 수집하였다.

병원균을 분리하기 위해 점무늬가 형성된 과실과 배꼽부위가 썩은 과실 부위를 메스로 잘라 1% 차아염소산나트륨 용액으로 1분간 침지하고 멸균수로 충분히 세척 후 필터페이퍼를 이용하여 물기를 제거하여 물한천배지(Water Agar, WA)와 감자한천배지(Potato Dextrose Agar, PDA)에 치상하여 25°C 인큐베이터에서 배양하였다. 3일 후 자라나온 곰팡이의 선단을 취해서 PDA에 옮기고 순수배양하였다. 세균은 검출되지 않았다. 미이라화 된 사과에서는 표면에 형성된 포자를 긁어 살균수에 현탁한 후 Acidified PDA (APDA) 배지에 도말하여 배양하였고, 2-3일 후 형성된 균총을 새로운 PDA에 옮겨 순수분리하였다.

Koch의 법칙을 증명하기 위하여 분리된 균주를 이용하여 병원성 검정을 하였다. 재배되고 있는 후지 품종의 사과를 70% 에탄올 용액으로 표면살균하고, 살균수로 세척한 후 자연 건조하였다. 각 병징에서 분리된 곰팡이 균주(AM1: 미이라된 과실, AS1: 점무늬증상, AC1: 배꼽썩음)를 PDA배지에서 7일간 배양된 곰팡이 조각(5 mm)을 사과 표면에 살균된 메스로 상처를 낸 부위에 접종하였다. 균주당 5 반복으로 처리하였다. 접종된 사과는 플라스틱 용기에 담아 25°C 인큐베이터에 두면서 병 진전 상황을 조사하였다. 플라스틱 용기는 살균된 페이퍼타올을 깔고 물을 넣어 습실이 유지되게 하였다. 접종한 과실에서는 1일 후부터 갈변하기 시작하였으며 3일 후에는 2 cm 이상의 병징을 보였고(Fig. 2B, Fig. 2C), 5일 후에는 과실의 1/3 이상이 썩었다(Fig. 2F, Fig. 2G). 10일 후에는 과실 전체가 갈변하고 썩었다. 병 진전이 급격히 이루어짐을 알 수 있었다. 포자현탁액을 10⁶ conida/ml의 농도로 조절하여 건전한 사과에 상처 없이 분무 접종한 결과 7일 후 점무늬 증상을 관찰할 수 있었다(Fig. 2D, Fig. 2H). 미이라 병징, 점무늬 병징, 꽃받침 썩음 병징에서 분리된 모든 균주가 병원성이 확인되었다. 병 발생이 된 부위에서 병원균을 분리한 결과 처음과 같은 곰팡이가 균일하게 분리되었으며, 염기서열 분석을 통해 같은 곰팡이임을 확인하였다.

분리한 곰팡이균을 PDA에 배양하자 25°C에서 매우 빨리 자랐으며 5일 후 직경 9 cm의 Petri-dish를 가득 채웠다. 배양 5일까지는 흰색의 곰팡이 균사가 자라다가(Fig. 3A) 서서히 잿빛, 암회색으로 변하기 시작하였고(Fig. 3B), 시간이 지날수록 검은색에 가까운 색으로 변하는 것을 관찰하였다. PDA배지 상에서는 흰색의 기중균사가 형성되었고(Fig. 3C, Fig. 3D), 분생포자가 잘 형성되지 않았으나 30일이 경과하였을 때 분생포자가 관찰되기 시작하였고 배지상에서 형성된 분생포자의 크기를 측정하였다. 미이라화 된 과실의 표면에는 분생포자가 많이 존재하였고 그 분생포자도 현미경으로 관찰하였다. 기주 및 배지상에서 형성된 분생포자를 관찰하면서 Phillips 등(2013), Sutton 등(2014)이 보고한 논문과 책을 참고하여 분류, 동정하였다. 분생포자가 형성되는 형태는 연쇄상 체인으로 형성되지 않고 병자각 안에 형성되었다. 분생포자는 대부분 갈색이었으며 간혹 투명한(hyaline) 포자가 관찰되었다. 분생포자는 격막이 없으며 타원형(ellipsoid)이었고 끝이 둥글었으며 점액질(mucoid sheath)로 쌓여 있지는 않았다(Fig. 4K, Fig. 4L). 50개의 분생포자를 광학현미경으로 관찰하면서 크기를 측정한 결과 기주에서 형성된 분생포자의 크기는 21.7-28.3×9.9-15.3 µm이었고, 배지에서 형성된 분생포자의 크기는 21.7-26.1×10.0-12.3 µm이었다. 과실에서 형성된 분생포자의 측정값이 배지상에서 생성된 분생포자보다 장경이 조금 더 긴 것도 있었지만 Table 1과 같이 보고된 Diplodia seriata의 포자 크기와 비슷한 범위였다. 미이라화된 과실의 표면을 얇게 잘라 광학현미경으로 병자각(Pycnidium)도 관찰할 수 있었다. 병자각의 크기는 200-540 µm로 다양하였으며, 둥근 공모양이었고, 여러 개가 연쇄상으로 관찰되었다(Fig. 4A, Fig. 4B). 병자 각 안에 분생포자를 관찰할 수 있었고(Fig. 4C, Fig. 4D), 다양한 conidiogenous cell에서 서서히 분생포자로 형성되는 것이 관찰되었으며(Fig. 4E-H), 점점 갈색으로 변하면서 분생포자로 형성되는 것도 확인할 수 있었다(Fig. I, J). 분생포자를 증류수에 현탁하여 22°C에 배양한 결과 4시간 후부터 발아하기 시작하여 12시간 후에는 100 µm 정도 자라는 것도 있었다(Fig. 4M, Fig. 4N). 이러한 균학적, 형태학적 특성은 Diplodia seriata De Not와 일치하였다(Phillips 등, 2013; Sutton 등, 2014).

균학적인 특성을 바탕으로 동정된 결과가 Diplodia seriata임을 증명하기 위하여 염기서열 분석으로 재확인하였다. PDA 배지에서 병원균을 일주일간 배양하여 Genomic DNA Prep kit (SolGent Co., Korea)을 이용하여 total genomic DNA를 추출하고 clean-up하였다. ITS1F/ITS4 (White 등, 1990)와 Bt2a/Bt2b (Glass와 Donaldson, 1995) primer 세트를 이용하여 각각 Internal Transcribed Spacer (ITS) region과 Beta-tubulin (β-tubulin) 유전자를 증폭하였다. 증폭된 PCR product를 Gel & PCR purification system (SolGent Co., Korea)를 사용하여 정제한 후 Solgent사에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열 정보를 GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information)에 등록되어 있는 염기서열들과 비교한 결과 ITS는 accession nos. MH665430, KY608885, MF289350, HQ629955, KY745784 균주와, β-tubulin 유전자는 accession nos. KX259170, KY701766, KF515960, MG015825와 각각 99% 이상 일치하여 Diplodia seriata로 동정되었다. 또한 분자계통학적 유연관계를 분석하기 위해 병원균의 염기서열과 Diplodia 속의 다른 종들의 염기서열을 NCBI Genbank database에서 수집하여 ITS 및 β-tubulin 유전자의 염기서열을 결합하여 분석하였다. 계통수는 MEGA 6.0 program을 이용하여 neighbor-joining 방법을 사용하였다(Phillips 등, 2013). ITS 및 β-tubulin 유전자의 염기서열을 이용하여 분자 계통학적 유연관계 분석 결과 Diplodia seriata로 그룹핑되었다(Fig. 5). 각 균주의 염기서열을 GenBank에 등록하였고(Accession Numbers. AM1: MK063792, AS1: MK063793, AC1, MK063794), 국립낙동강생물자원관 균주보존분양부에 기탁하였다(AM1: FDCC800787D, AS1: FDCC800788D, AC1: FDCC800789D). 이 곰팡이는 오랜 기간 Botryosphaeria obtusa로 알려져 왔다. Shaeria obtusa Schwein, Physalospora obtusa (Schwein) Cooke 등으로 학명의 변천이 있었다(Phillips 등, 2007). 그러나 Crous 등(2006)의 분자생물학적 근연관계 분석결과, Botryosphaeria 속에는 B. dothidea와 B. corticis만이 속하기 때문에 더 이상 B. obtusa로 사용하는 것은 맞지 않으며 D. seriata로 사용하여야 한다고 하였다(Lazzizera 등, 2008). 이 곰팡이에 의한 사과의 Black rot은 1879년 미국 뉴욕주에서 처음 보고되었고, 배, 살구, 복숭아, 포도 등 264개의 기주식물에 세계적으로 발생되고 있다(Sutton 등, 2014). 멕시코, 캐나다에서 발생 보고되고 있고, 미국에서는 사과 재배를 하는 워싱턴주, 캘리포니아주를 포함한 22개 주에서 보고되고 있다. 칠레, 브라질을 비롯한 남미, 이탈리아를 포함하여 유럽 20개국, 호주, 뉴질랜드, 남아프리카공화국 등에서 발생, 보고되어 있다. 아시아에서도 중국, 일본, 인도를 비롯한 10개국에서 분포하고 있다(https://www.cabi.org/isc/datasheet/9630). Diplodia seriata는 우리나라에서 식물병원균으로 보고되어 있지 않다. 우리나라에서 Diplodia seriata에 의한 사과 Black rot은 명확하게 동정되어 보고되지 않은 것으로 되어있다. 즉, 한국식물병목록(The Korean Society of Plant Pathology, 2009)에 의하면 “초기 연구에서 Botryosphaeria dothidea에 의한 겹무늬썩음병(White rot)과 B. obtusa (현재의 Diplodia seriata)에 의한 검은썩음병(Black rot) 간의 혼동이 많았으므로 한국에서의 발생은 불확실함”이라고 서술되어 있다. Botryosphaeria dothidea에 의한 겹무늬썩음병은 사과재배지에서 매년 발생하여 문제가 되고 있지만 이번에 영천지역 사과재배지에서 발견된 검은썩음병은 우리나라에서 처음으로 관찰되고 병원균이 분리되어 동정되었다. 이 병은 개화기간 또는 낙화직후에 침입하여 씨방을 썩히거나, 배꼽부위(꽃받침)부터 심하게 썩어 들어가 짧은 시간에 미이라 형태로 변하는 것으로 생각된다. 이렇게 미이라가 된 과실 표면의 분생포자가 비바람에 의해 비산되면 주위의 건전한 과실로 전파되는데 상처가 있을 시에는 과실을 심하게 부패시키나 상처가 없을 때에는 침입력이 약하여 과실 표면에서 점무늬형태의 병반으로 형성되는 것으로 생각된다. 이 병이 발생한 사과 경작자에 의하면 이러한 증상은 2년 전부터 관찰되었고, 그동안 탄저병, 겹무늬썩음병이나 과심곰팡이병으로 생각하였다고 한다. 그러므로 이 병원균은 우리나라 여러 작물에 존재하고 있을 것으로 판단된다. 추후 이 병원균의 다양한 기주에서의 발생 모니터링이 필요하다고 생각된다. 이 병의 방제를 위해서 병든 과실과 가지, 특히 포자가 많이 형성된 미이라된 과실을 제거하는 것이 중요하며, 캡탄, 티오파네이트메틸(thiophanate-methyl), QoI (quinone outside inhibitor) 살균제를 살포하면 효과적이라고 한다(Sutton 등, 2014). 우리나라 사과에서 처음 발생한 Black rot의 발생생태 및 약제에 대한 연구가 앞으로도 계속 지속되어야 할 것으로 생각된다.