2012년 11월 충청남도와 제주도를 제외한 전국 1,482개 딸기재배농가에서 딸기세균모무늬병 발생을 조사하였다. 또한 2012년 1월부터 2015년 1월까지 딸기세균모무늬병이 처음 발견된 진주시 수곡면과 하동군 옥동면 딸기재배포장에서 딸기세균모무늬병 발생 변화를 관찰하였다. 수곡면과 하동군의 딸기재배포장을 임의로 각 40포장을 선정하여 각 재배포장에서 병 발생을 조사하였다.

2011년 10월 경남 진주시 수곡면과 하동군 옥종면에서 딸기세균모무늬병 증상이 있는 병든 조직을 수거하여 실험실에서 병원세균을 분리하였다. 딸기세균모무늬병징이 있는 조직을 70% 알코올에 30초 동안 표면살균하였다. 표면살균된 병든 부위를 작은 조각으로 자르고 50 μl 살균수에 담근 후 살균된 루프로 마쇄하였다. 마쇄된 현탁액을 살균된 플라스틱 루프에 묻혀 yeast extract-dextrose-CaCO (YDC) 한천 배양기에 획선배양하였다. 접종된 배양기를 26°C에서 4-7일 배양하여 병원세균을 분리하였다. 순수 분리된 병원균은 20% glycerol 용액에 혼합 후 70°C 보관하여 필요할 때 사용하였다(Table 1).

딸기는 25°C-28°C, 상대습도 75%로 유지되는 국립농업과학원 유리온실에서 재배하였다. 상토가 담긴 포트에 이식된 유묘는 삼출엽(trifoliate)이 충분히 확대되었을 때 분리된 세균의 병원성 검정과 딸기세균모무늬병균 BC3191과 BC3195에 대한 딸기 품종들의 저항성 평가에 사용되었다.

분리된 세균은 매향을 대상으로 병원성을 검정하였다. YDC 배양기에서 수거된 세균을 OD₆₀₀=0.1 (~10⁸ colony forming unit/ml) 농도로 조정하였다. 세균현탁액을 살균된 1 ml 주사기에 넣고 주사바늘을 제거한 후 잎 뒷면에 수침상이 보일 때까지 주입하였다. 병원균이 주입된 잎은 투명 플라스틱 상자에 넣고 7일 후 관찰하였다. 병든 부위에서 위에서 설명한 것과 같이 병원세균을 YDC 배양기에서 재분리하였다. 재분리된 세균의 균총 형태와 색을 접종된 균과 비교하여 확인하였다.

생리·생화학반응에 사용된 세균은 YDC 배양기에서 26°C, 72시간 동안 배양하여 사용하였다. 분리된 딸기세균모무늬병균의 생리·생화학반응조사는 Schaad 등(2001)의 추천에 따라 수행하였다. YDC 배양기에서 점질생장은 접종 72시간 후 조사하였다. Gram 반응은 KOH 조사(Suslow 등, 1982)로 대신하였다. 35°C에서 생장은 변형된 yeast salts agar (YS; 증류수 1 l당 NH₄H₂PO₄ 0.5 g, K₂HPO₄ 0.5 g, MgSO₄·7H₂O 0.2 g, NaCl 5.0 g, yeast extract 1.0 g, cresol red 16.0 mg, urea 20.0 g) 배양기에 접종 12일 후 병원세균생장을 조사하였다. SX 배양기(증류수 1 l당 starch [soluble-potato] 10.0 g, beef extract 1.0 g, ammonium chloride 5.0 g, K₂HPO₄ 2.0 g, methy violet 2B 10 mg, methy green 20 mg, cycloheximide 50 mg)에서 성장은 Schaad와 White (1974)의 방법으로 조사하였다. 전분 가수분해 조사는 NSCAA 배양기(증류수 1 l당 nutreient agar 23.0 g, starch [soluble-potato] 15.0 g, cycloheximide 50 mg, nitrofurantoin 10 mg, vancomycin 0.5 mg)를 사용하여 Randhawa와 Schaad (1984)의 방법으로 조사하였다. Esculin 가수분해는 YS 배양기에 ferric ammonium citrate 0.05%와 esculin 0.1%를 첨가하여 pH 6.8로 조정된 배양기에서 접종 후 28일 동안 조사하였다. 단백질가수분해와 litmus milk 조사는 살균된 skim milk에 0.004% bromocresol purple이 첨가된 배양기에서 조사하였다. 빙핵생성(ice nucleation)은 Handelsman 등(1996)의 방법으로 조사하였다. King’s B 배양기에서 3일 배양된 세균을 살균된 ultra-pure water에 현탁시켰다. 현탁액을 -10°C에서 10분 후 빙핵형성을 조사하였다. Arabinose를 이용한 산생성과 세균생장에 glycerol과 melibiose 이용은 Dye (1968)의 배양기 C (증류수 1 l당 NH₄H₂PO₄ 0.5 g, K₂HPO₄ 0.5 g, MgSO₄·7H₂O 0.2 g, NaCl 5 g, yeast extract 1 g, agar 12 g, bromocresol purple 0.7 ml of 1.5% alcohol solution; pH 6.8)에 arabinose, gycerol, melibiose를 0.5% 첨가한 배양기에서 14일까지 조사하였다.

분리된 세균을 YDC 배양기에 접종 후 5일 동안 26°C에서 배양하였다. 배양된 세균을 수거하여 QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)를 사용하여 제조자 추천방법으로 핵산을 분리하였다.

핵산증폭은 50 μl 반응액에서 수행하였다. PCR 반응액 조성은 핵산 20 ng, Taq DNA polymerae 0.2 U, dNTP 200 킡, MgCl₂ 1.5 mM, 프라이머 10 pmole이었다.

딸기세균모무늬병균의 chaperone protein (dnaK), TonB-dependent receptor (fyuA), DNA gyrase subunit B (gyrB), RNA polymerase sigma factor (rpoD) 유전자를 분석하였다(Young과 Park, 2007). PCR 증폭은 상기 PCR 반응액 조성으로 94°C에서 3분 동안 핵산을 변성시킨 후 94°C에서 30초, 57°C에서 30초, 72°C에서 1분 과정을 30회 반복하고 72°C에서 10분 동안 최종 증폭하였다. PCR 증폭 및 유전자 염기서열분석을 위하여 danK 유전자에 대하여 XdanK1F (5’-GGTGGAAGACCTGGTCAAGA-3’)/XdnaK1R (5’-TCCTTGACYTCGGTGAACTC-3’), fyuA 유전자에 대하여 XfyuA1F (5’-AGCTACGAYGTGCGYTACGA-3’)/XfyuA1R (5’-GTTCACGCCRAACTGGTAG-3’), gyrB 유전자에 대하여 XgyrB1F (5’-ACGAGTACAACCCGGACAA-3’)/XgurB1R (5’-CCCATCARGGTGCTGAAGAT-3’), rpoD 유전자에 대하여 XrpoD1F (5’-TGGAACAGGGCTATCTGACC-3’)/XrpoD1R (5’-CATTCYAGGTTGGTCTGRTT-3’) 프라이머 조합을 사용하였다. 증폭된 핵산은 NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel, Düren, Germany)를 사용하여 제조사 추천방식으로 순수 분리하였다. 순수 분리된 핵산은 위의 프라이머 조합으로 염기서열을 분석하였다. 각 유전자의 염기서열은 BigDye Terminator Ready Reaction Mix ver. 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 이용하여 각 유전자를 증폭하였으며, 회로순환결정방법으로 염기서열을 결정하였다. ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer로 양방향 염기서열이 결정되었다.

Multlocus sequence analysis (MLSA)를 수행하였다. 국내에서 분리된 X. fragariae의 fyuA, dnaK, gyrB, rpoD 유전자와 GenBank에서 얻은 Xanthomonas속 15종의 대표균주와 X. fragariae 3균주의 유전자 염기서열을 BioEdit ver. 7.2.5 (Hall, 1999)를 사용하여 정렬(alignment)하였다. 정렬된 3,376 points의 염기들은 MEGA 소프트웨어 ver. 6.06 (Tamura 등, 2013)의 Jukes-Cantor 모델을 이용하여 neighbor-joining 방법으로 계통수(phylogenetic tree)를 작성하였다.

국내에서 분리된 병원세균 BC3191과 BC3195를 사용하였다. 저항성 평가에 사용된 세균 BC3191과 BC3195는 국내에서 분리된 세균의 생리생화학적 특성과 유전적 특성에서 차이를 보이지 않아 임의로 선발하여 사용하였다. 국립원예특작과학원 채소과에서 보존하고 있는 18종류의 딸기품종(금향’, ‘도치노미네’, ‘도치오도메’, ‘대왕’, ‘레트펄’, ‘매향’, ‘보교조생’, ‘베니홋베’, ‘사찌노카’, ‘설향’, ‘수홍’, ‘숙향’, ‘스위트찰리’, ‘죽향’, ‘아키히메’, ‘옥매’, ‘싼타’, ‘페스티발’)을 분양 받아 저항성 조사를 수행하였다. Maas 등(2000)의 방법을 이용하여 병원세균을 딸기 잎에 주사로 주입접종을 하였다. 삼출잎에 잎당 2지점에 접종하였다. 세균현탁액(1×10⁸ cfu/ml)을 살균된 1 ml 주사기에 넣고 주사바늘을 제거한 후 잎 뒷면에 수침상이 보일 때까지 주입하였다. 한 품종당 두 식물체를 사용하여 2회 반복하였다. 접종된 잎은 투명한 프라스틱 백에 넣어 3일 동안 그늘진 온실에서 배양하였다. 플라스틱 백을 벗기고 11일 후 접종 위치의 병든 정도를 근거로 접종 위치에 0-5등급을 주었다(Maas 등, 2000). 등급 ‘0’은 병 반응이 없을 때, ‘1’은 접종 위치가 수침상을 보일 때, ‘2’는 접종 위치 중앙부가 약간 황화되거나 괴저증상이 보일 때, ‘3’은 접종 위치에서 수침상 증상이 확산되고 세균덩어리가 밖으로 유출될 때, ‘4’는 접종 위치에서 괴저 증상이 확산되거나 2차 전염이 있을 때, ‘5’는 접종 위치가 괴저 증상을 보이고 잎이 황화에서 적갈색으로 변할 때 주었다. 감수성 표준으로 스위트 찰리 품종을 사용하였다(Lewers 등, 2003).