Strobilurin계 살균제에 대한 고추탄저병균의 교차저항성과 Pyraclostrobin 저항성균에 대한 다른 기작 살균제의 억제 효과

Cross-resistance of Colletotrichum acutatum s. lat. to Strobilurin Fungicides and Inhibitory Effect of Fungicides with Other Mechanisms on C. acutatum s. lat. Resistant to Pyraclostrobin

Article information

Res. Plant Dis. 2022;28(3):122-131
Publication date (electronic) : 2022 September 30
doi : https://doi.org/10.5423/RPD.2022.28.3.122
Department of Plant Medicine, Chungbuk National University, Cheongju 28644, Korea
박수빈, 김흥태,orcid_icon
충북대학교 농업생명환경대학 식물의학과
Corresponding author Tel: +82-43-261-2556 Fax: +82-43-271-4414 E-mail: htkim@cbnu.ac.kr
Received 2022 September 1; 2022 September 18; Accepted 2022 September 18.

Abstract

Pyraclostrobin에 대해서 감수성균인 Colletotrichum acutatum s. lat. 20JDS8과 저항성인 20CDJ6을 사용하여, strobilurin 계에 속하는 살균제와의 교차 저항성 여부와, 작용기작이 다른 살균제의 저항성균에 대한 작용 특성을 조사하였다. Pyraclostrobin 저항성 20CDJ6은 strobilurin계인 azoxystrobin, trifloxystrobin, kresoxim-methyl에 대해서도 저항성을 보여, 교차 저항성 관계가 있음을 알 수 있었다. 작용기작이 다른 모든 살균제는 감수성과 저항성균 모두의 균사 생장을 억제하였지만, 열매에서 병 방제 효과는 서로 달랐다. Isopyrazam의 20JDS8과 20CDJ6에 대한 병 방제효과는 매우 낮았으며, fluazinam은 열매에 상처를 내지 않고 예방적으로 처리하였을 때만 20JDS8과 20CDJ6에 대해서 91.9%와 88.1%의 방제 효과를 보였다. Tebuconazole과 prochloraz는 PDA 배지 상에서 20JDS8과 20CDJ6의 균사생장뿐만 아니라 고추 열매에서 병 발생도 효과적으로 억제하였다. 본 연구의 결과, pyraclostrobin 에 대해서 저항성인 고추탄저병균은 strobilurin계의 다른 살균제와 교차 저항성을 보였다. 또한 pyraclostrobin 저항성균의 방제를 위한 대체 살균제로 작용기작이 다른 fluazinam, tebuconazole, prochloraz 등을 추천할 수 있을 것으로 생각한다. 다만, fluazinam은 병 발생 이전에 예방적으로 처리하여야만 효과를 얻을 수 있다.

Trans Abstract

Colletotrichum acutatum s. lat. 20JDS8 sensitive and 20CDJ6 resistant to pylaclostrobin were used to investigate the cross-resistance with fungicides belonging to the strobilurins and the characteristics of fungicidal controlling activities with different mechanisms against the isolate resistant to the fungicide. The resistant isolate of 20CDJ6 also showed the resistance to azoxystrobin, trifloxystrobin, and kresoxim-methyl, suggesting that there is a cross-resistance relationship. All fungicides with different action mechanisms inhibited mycelial growth of both susceptible and resistant isolates of C. acutatum s. lat., but their disease control effects in fruits were different according to the fungicides. The disease control effect of isopyrazam against 20JDS8 and 20CDJ6 was very low, and fluazinam showed a control effect of 91.9% and 88.1% against 20JDS8 and 20CDJ6 only when it was treated before inoculation by spraying spore suspensions on pepper fruits without wounds. Tebuconazole and prochloraz effectively inhibited not only the mycelial growth of 20JDS8 and 20CDJ6 on potato dextrose agar medium, but also disease incidence in red pepper fruits. As a result of this study, C. acutatum s. lat. 20CDJ6 resistant to pyraclostrobin showed cross-resistance with other strobilurin fungicides. In addition, we think that fluazinam, tebuconazole, and prochloraz can be recommended as alternative fungicides for the control of red-pepper pyranthracnose pathogens resistant pyraclostrobin. However, fluazinam can be effective only if it is treated protectively before the occurrence of the disease.

서 론

살균제란 식물병원균의 피해를 막기 위하여 식물체에 처리하여, 병원균을 죽이거나 식물체에서 병 저항성을 유기하는 화합물, 천연물 및 미생물을 말한다. 이 중 유기합성을 통해서 만든 화학 살균제는 1900년대 이후에 개발되기 시작하였으며, 1970년대 이후에 개발된 살균제는 식물체로의 침투이행성과 치료 효과, 그리고 병원균에 대한 특이적인 작용점을 갖는 특징이 있다(Tudi 등, 2021). 살균제가 병원균에 대해서 특이적인 작용점을 가지게 되면서 인축이나 환경에 대한 안전성은 높아졌지만, 살균제에 대한 병원균들의 저항성 발현이라는 다른 문제가 발생하게 되었다.

Strobilurin계 살균제는 1996년에 개발된 azoxystrobin 을 비롯하여 2002년까지 6종의 살균제가 등록되어 사용되기 시작하였다(Rural Development Administration, 2022). Azoxystrobin은 개발 초기부터 72개국에서 84종의 작물에서 사용되기 시작하였으며, 약 400여종의 식물병원균의 방제에 사용될 정도로 적용 범위가 넓었다(Bartlett 등, 2002). 고추 탄저병의 방제를 위해서는 pyraclostrobin이 2002년에, trifloxystrobin과 azoxystrobin은 2003년과 2008년에 등록되어 사용되고 있다. Strobilurin계 살균제는 식물 병원성 곰팡이의 미토콘드리아 내막에 존재하는 cytochrome bc1 복합체의 한 부분인 cytochrome b에 부착하여 미토콘드리아의 호흡을 저해하는 특이한 작용기작을 갖는다(Bartlett 등, 2002). 이런 strobilurin계 살균제는 반복적으로 사용할 경우 저항성균이 쉽게 나타날 수 있는 단점이 있다. 실제 strobilurin계 살균제에 대한 저항성균의 발생은 1998년 독일 북부의 밀 재배 지역에서 흰가루병균인 Blumeria graminis f. sp. tritici에서 최초로 보고되었다(Heaney 등, 2000). 그 후 흰가루병균, 노균병균, Alternaria spp., Pyricularia grisea, Venturia sp. 등 다양한 식물병원균에서 저항성균의 발생에 대한 보고가 이어졌다(Collina 등, 2005; Ishii 등, 2001; Kim 등, 2003, 2008; Ma 등, 2003; Sierotzki 등, 2000; Steinfeld 등, 2001). 이런 strobilurin계 살균제 저항성은 cytochrome b 유전자의 143번째 아미노산이 glycine (GGT)에서 alanine (GCT)으로 치환되는 점 돌연변이에 의해서 발생한다(Gisi 등, 2002).

국내에서 고추 탄저병 방제용 살균제는 381개 품목이 등록되어 사용되고 있는데(Rural Development Administration, 2022), strobilurin계 살균제는 단제 78종, 합제 63종으로, 전체 등록 품목의 37.0%를 차지하고 있다. Strobilurin계 살균제는 6종이 등록되어 있는데, 그 중에서 pyraclostrobin이 strobilurin 계 살균제의 37.0%를 차지할 정도로 많이 등록되어 있다. 많은 품목이 등록되어 있기 때문에, 포장에서의 사용량도 많을 것으로 예상되는 pyraclostrobin에 대한 고추탄저병균의 저항성은 2015년에 청양, 공주, 부여, 익산 지역의 고추 재배 지역에서 채집한 병원균에서 처음 보고되었으며(Kim 등, 2019), 최근에는 전국적으로 저항성균의 발생이 확대되었다(Isa 등, 2020). 이처럼 고추 탄저병에 대한 방제 효과가 우수한 pyraclostrobin 에 대한 저항성 탄저병균의 발생이 보고되어 있음에도 불구하고, 농가 현장에서는 여전히 작용기작 그룹이 동일한 ‘다3’군의 살균제를 다른 살균제로 오인하며 사용하는 사례가 발생하고 있다. 이런 현장의 문제를 방지하기 위하여, 작용기작이 동일한 그룹에 속하는 살균제 간의 교차 저항성 여부를 명확하게 규명하여야 할 필요가 있었다. 본 실험에서는 pyraclostrobin 감수성과 저항성 탄저병균을 사용하여 동일한 작용기작을 갖는 strobilurin계 살균제에 대한 교차 저항성 여부를 한천희석법과 고추 열매 검정법을 이용하여 조사하였다. 또한 작용기작이 다른 그룹의 살균제를 선발하여 pyraclostrobin 저항성균에 대한 균사생장 억제효과와 병 방제효과를 동일한 방법으로 조사하여 작용기작이 다른 살균제를 교호 살포해야 하는 이유를 규명하고자 하였다.

재료 및 방법

실험에 사용한 병원균.

고추 포장에서 뚜렷한 탄저병의 병징을 보이는 열매를 채집하여 단포자를 분리하였다. 고압 멸균한 이쑤시개를 이용하여 병징 부위에 형성된 분생포자를 떼어 멸균증류수(300 μ g/ml의 streptomycin 첨가)에 넣고 고르게 섞어 포자 현탁액을 만들었다. 포자 현탁액의 밀도를 1×10⁴ 개/ml로 조절한 후, 50 μ l를 300 μ g/ml의 streptomy-cin이 첨가된 PDA 배지(potato dextrose agar; Becton, Dick-inson and Company, Difco, Sparks, MD, USA)에 도말하여 25 o C 배양기에서 2일간 배양하였다. 배지에 형성된 단균총을 새로운 PDA 배지에 접종하고 25 o C에서 10일간 배양하였다. 분리한 고추탄저병균에서 pyraclostrobin에 대해서 감수성인 균주와 저항성인 균주를 각각 1균주씩 선발하여 실험에 사용하였다. C. acutatum s. lat. 20JDS8은 pyraclostrobin에 대한 EC50값이 10 μ g/ml 이하인 감수성균이었으며, C. acutatum s. lat. 20CDJ6은 10 μ g/ml 이상인 저항성균이었다. 두 균주는 PDA 사면배지에 접종하고 25 o C에서 10일간 배양한 후, 4 o C에서 보관하며 실험에 사용하였다.

실험에 사용한 살균제.

Strobilurin계 살균제 간의 교차저항성 조사를 위해서 pyraclostrobin (다3, a.i. 20%, WG), azoxystrobin (다3, a.i. 21.7%, SC), trifloxystrobin (다3, a.i. 22%, SC), kresoxim-methyl (다3, a.i. 44.2%, SC)을 선발하여 한천희석법과 고추 열매 접종법을 실시하였다. 살균제의 농도는 한천희석법에서는 10, 2, 0.4, 0.08, 0.016 μ g/ml로, 열매 접종법에서는 67 μ g/ml로 조절하여 사용하였다. 또한 작용기작이 다른 살균제의 pyraclostrobin 저항성균에 대한 효과를 검정하기 위해서 pyraclostrobin(다3, a.i. 20%, WG)과 더불어 dithianon (카, a.i. 75%, WP), isopyrazam (다2, a.i. 12.57%, EC), fluazinam (다5, a.i. 50%, WP), tebuconazole (사1, a.i. 25%, WP), prochloraz (사1, a.i. 25%, EC)를 선발하여 균사생장 억제효과와 병 방제 효과를 조사하였으며, 사용한 살균제의 최종 농도는 Table 1과 같이 조절하였다.

Fungicides and their concentrations used in each test method

균사생장 억제효과 검정.

실험에 사용한 살균제는 멸균증류수에 현탁하여 멸균한 PDA 배지에 첨가하였으며, 세균 오염을 방지하기 위해 PDA 배지에 300 μ g/ml의 streptomycin을 첨가하였다. Pyraclostrobin 감수성 C. acutatum s. lat. 20JDS8과 저항성 C. acutatum s. lat. 20CDJ6을 25 o C의 PDA 배지에서 14일간 배양한 후, 균총의 선단에서 직경 3 mm의 균사 조각을 떼어 접종원으로 사용하였다. 접종원의 균사 조각을 살균제를 농도별로 첨가한 PDA 배지의 중앙에 균사면이 배지를 향하도록 뒤집어서 접종하였다. 병원균을 접종한 배지는 25 o C의 암조건에서 5–7일간 배양한 후, 살균제를 첨가하지 않은 배지에서 균총의 직경이 약 40 mm 전후가 되었을 때, 직경을 조사하고, 아래 식에 의해서 살균제의 균사생장 억제율(%)을 계산하였다.

Inhibition ratio (%)of mycelial growth=(1Colony diameter on PDAamended with fungicideColony diameter on PDAamended without fungicide)×100

상처 접종을 통한 병 방제 효과 검정.

혈당침(softclix, 0.4 mm, ACCU-CHEK, Seoul, Korea)을 사용하여 고추 열매의 상단, 중단, 하단의 총 3곳에 상처를 유발하였다. PDA 배지에서 각각 형성된 pyraclostrobin 감수성과 저항성 고추탄저병균 C. acutatum s. lat. 20JDS8과 20CDJ6의 포자를 수확하여 현탁액의 포자 밀도가 1×106개/ml가 되도록 조정하고, 실험에 사용한 살균제를 포자 현탁액에 정해진 농도가 되도록 조절하여 처리하고, 고추 열매의 상처 부위에 15 μ l씩 점적하여 접종하였다. 병원균의 포자를 접종한 고추 열매는 플라스틱 용기에 넣고 5일간 25 o C의 암 상태에서 습실 처리하였다. 습실처리를 위하여 각 플라스틱 상자에 종이 타올을 2장씩 깔고, 증류수를 100 ml 씩 부어 주었다. 습실 처리가 끝난 고추 열매는 플라스틱 상자의 뚜껑을 열고 상온에서 다시 5일간 보관하며 발병을 유도하였다. 병 발생 정도는 상처 부위에 형성된 병반의 길이를 측정하여 조사하였으며, 살균제의 병 방제 효과는 아래식으로 계산하였다.

Controlling efficacy(%)=(1Long length of lesions inoculated withfungicide-treated spore suspensionLong length of lesions inoculated withfungicide-untreated spore suspension)×100

무상처 접종을 통한 병 방제 효과 검정.

PDA 배지에서 형성된 C. acutatum s. lat. 20JDS8과 20CDJ6의 포자를 수확하여 현탁액에서 포자 밀도를 1×106개/ml로 조절하였다. 병원균의 포자 현탁액을 고추 열매에 분무 접종한 후에, 접종한 고추 열매를 25 o C의 암 상태에서 5일간 습실 처리하고, 습실을 제거한 후 다시 25 o C에서 5일간 보관하며 발병을 유도하였다. 실험에 사용한 살균제는 병원균의 포자를 접종하기 1일 전과 1일 후에 각각 고추 열매에 살포하여 예방 효과와 치료 효과를 조사하였다. 예방 효과 검정 시 살균제 용액은 병원균을 접종하기 1일 전에 분무 처리하고, 고추 열매를 상온에서 1일간 풍건한 후 병원균을 접종하였다. 치료 효과는 병원균을 분무 접종하여 1일간 습실 처리한 후, 열매를 1시간 풍건하고 살균제를 처리하였다. 살균제 처리 후에는 곧바로 다시 바로 습실 처리하여 발병을 유도하였다. 살균제의 예방 효과와 치료 효과는 각 처리구의 열매에 발생한 탄저병의 발병도를 조사하여 무처리구 열매의 발병도와 비교하여 계산하였다. 모든 처리는 3반복으로 실시하였으며, 처리당 5개의 고추 열매를 사용하였다. 열매에서의 발병 정도는 발병지수로 조사한 값을 아래 식을 이용하여 발병도로 계산하였다. 발병지수의 기준은 Table 2와 같았다.

Criteria for the disease index on pepper fruit

Disease incidence(%)=i=0k(i×Number of pepper fruits)Long length of lesions inoculated withfungicide-untreated spore suspension)×100

i=disease index, k=constant of incidence index, N=Total number of fruits in each replication.

각 처리의 병 방제 효과(%)는 발병지수를 이용하여 조사한 발병도를 사용하여 아래식으로 계산하였다.

Controlling efficacy(%)=(1Disease incidence of pepper fruitstreated with fungicidesDisease incidence of pepper fruitsnot treated with fungicides)×100

결과 및 고찰

한천희석법을 이용한 strobilurin계 살균제의 균사생장 억제효과.

Pyraclostrobin 감수성인 C. acutatum s. lat. 20JDS8의 pyraclostrobin에 대한 EC50값은 0.1 μ g/ml이었지만, azoxystrobin, trifloxystrobin, kresoxim-methyl에 대한 EC50값은 모두 100 μ g/ml 이상으로 나타났다. 반면에 저항성균인 20CDJ6의 pyraclostrobin에 대한 EC50값은 100 μ g/ ml 이상이었으며, 세 약제에 대한 EC50값은 역시 100 μ g/ml 이상이었다. Pyraclostrobin에 대한 EC50값은 감수성균과 저항성균 사이에 뚜렷한 차이가 있었으나, 저항성균과 감수성균 각각의 azoxystrobin, trifloxystrobin, kresoxim-methyl 에 대한 EC50값이 너무 커서, 감수성균과 저항성균 간에 뚜렷한 차이를 비교하기가 어려웠다. 하지만 azoxystrobin, trifloxystrobin, kresoxim-methyl의 동일한 농도에서 20JDS8과 20CDJ6에 대한 균사생장 억제효과를 비교하여 보면, 감수성인 20JDS8에 대한 억제효과가 저항성인 20CDJ6에 대한 효과보다 높았다. 이상의 결과는 strobilurin계에 속하는 pyraclostrobin을 비롯한 azoxystrobin, trifloxystrobin, kresoxim-methyl 등의 살균제 간에는 교차 저항성 관계가 있음을 보여주고 있었다(Fig. 1). 하지만 Fig. 1에서 보는 것과 같이 동일한 계열에 속하는 살균제라고 하여도 감수성균인 C. acutatum s. lat. 20IDS8에 대한 균사생장 억제효과에는 차이가 심하였다. 많은 식물병원균에서 살균제의 효과를 검정하거나 살균제에 대한 저항성 발생 모니터링을 실시할 때 사용하는 방법이 한천희석법을 이용한 균사생장 억제효과 검정이다(Kim 등, 2004). 그런데 strobilurin계 살균제는 미토콘드리아 내막에서 전자전달에 관여하는 효소의 활성을 억제하는 작용기작을 가지고 있다(Gisi 등, 2002). 그런데 배지 상에서 균사생장 억제효과를 검정할 때, Botrytis cinerea와 같이 그 효과가 나타나지 않거나, 병원균에 대한 억제효과가 낮게 나타나는 경우가 있기 때문에, 실내 검정 시에 유의하여야 한다(Kim 등, 2014). 결국 Fig. 1에서 보는 것과 같이 pyraclostrobin을 제외한 azoxystrobin, trifloxystrobin, kresoxim-methyl의 고추탄저병균에 대한 효과 검정을 한천희석법을 사용하여 균사생장 억제효과를 조사한다면, 감수성균과 저항성균 간의 뚜렷한 차이를 보기가 어려울 수도 있다. 따라서 한천희석법을 사용하여 균사생장 억제효과를 조사하는 방법으로 strobilurin계 살균제에 대한 고추탄저병균의 저항성 모니터링을 실시할 때에는, pyraclostrobin을 사용하여 고추탄저병균에 대한 효과를 검정하는 것이 감수성과 저항성균 간의 차이를 뚜렷하게 보여줄 수 있다.

Fig. 1

Mycelial growth inhibiting ratio (%) of Colletotrichum acutatum s. lat. 20JDS8 (A) and 20CDJ6 (B) causing pepper anthracnose in PDA treated with fungicides. Isolate 20 JDS8 was sensitive to pyraclostrobin, and 20CDJ6 was resistant. The inhibition rate was investigated by agar dilution method on potato dextrose agar (PDA) medium. After incubating the medium inoculated with the pathogen for 5 to 7 days in a dark condition at 25°C, when the diameter of the colony became about 40 mm in PDA treated without any fungicides, the colony diameter of C. acutatum s. lat. was measured, and the mycelial growth inhibition rate (%) was calculated.

고추 열매 검정을 이용한 strobilurin계 살균제의 예방 및 치료 효과.

고추 열매에 pyraclostrobin에 대해서 감수성과 저항성인 병원균의 포자 현탁액을 각각 상처 점적 접종하여 pyraclostrobin의 효과를 조사하였다. Fig. 2에서 보는 것처럼 감수성균의 방제 효과는 85.1%이었지만, 저항성균의 효과는 17.7%로 급감하였다. 이런 현상은 상처 점적 접종뿐만 아니라 무상처 분무 접종한 경우에도 동일하게 나타났다(Fig. 3). 감수성균인 20JDS8을 접종하였을 때, pyraclostrobin의 예방 및 치료 효과는 71.4%와 76.5%이었지만, 저항성균인 20CDJ6을 사용하였을 경우에는 11.9%와 0.7%로 감소하였다.

Fig. 2

Disease control efficacy of pyraclostrobin on Colletotrichum acutatum s. lat. 20JDS8 and 20CDJ6 causing pepper anthracnose in an wound inoculation experiment. Isolate 20 JDS8 was sensitive to pyraclostrobin, and 20CDJ6 was resistant. (A) The disease control efficacy calculated with the lesion length of the fungicide-applied treatment versus the lesion length of the non-pyraclostrobin-ap-plied treatment. (B) The lesions that occurred when C. acutatum s. lat. 20JDS8 and 20CDJ6 were inoculated on untreated and treated peppers with pyraclostrobin, respectively.

Fig. 3

Protective and curative effects of pyraclostrobin against the susceptible isolate 20JDS8 and resistant isolate 20CDJ6 of Colletotrichum acutatum s. lat. in a non-wound inoculation experiment. (A) The disease control efficacy calculated with the disease incidence on a pepper fruit. (B) The lesions that occurred when C. acutatum s. lat. 20JDS8 (B-1 and B-2) and 20CDJ6 (B-3 and B-4) were inoculated by spraying spore suspensions on unwound pepper fruits. Pyraclostrobin was treated before (B-1 and B-3) and after (B-2 and B-4) inoculation. In all photos, the left side is the pepper fruit not treated with pyraclostrobin, and the right side shows the pepper fruit treated with pyraclostrobin.

무상처 분무 접종을 통하여 pyraclostrobin과 동일한 계열에 속하는 azoxystrobin, trifloxystrobin, kresoxim-methyl의 탄저병 방제 효과를 조사하였다. 20JDS8에 대한 azoxystrobin, trifloxystrobin, kresoxim-methyl의 예방 효과는 76.9%, 78.9%, 69.2%이었으며, 20CDJ6에 대한 예방 효과는 2.1%, 29.8%, 19.2%이었다(Figs. 4, 5). 병원균을 먼저 접종하고 살균제를 처 리한 치료 효과 검정에서도 감수성균과 비교하여 저항성균에 대한 효과가 감소하다. 결국 고추 열매 검정에서도 한천희석 법을 이용한 균사생장 억제효과 검정과 동일하게 strobilurin 계 살균제인 pyraclostrobin, azoxystrobin, trifloxystrobin, kresoxim-methyl 간의 교차 저항성이 인정되었다.

Fig. 4

Effect of fungicides used as preventive and curative application on pepper fruits sprayed with conidial suspension of Colletotrichum acutatum s. lat. 20JDS8 (A) and 20CDJ6 (B). The difference between each treatment was tested by Duncan for protective and curative effects, respectively. Values labeled with the same letter are not significantly different in Duncan's multiple range test at P=0.05.

Fig. 5

Control effect of 3 fungicides on pepper anthracnose caused by Colletotrichum acutatum s. lat. Diluted with a field dilution fold, 3 fungicides were applied before and after inoculation with a susceptible isolate 20JDS8 and a resistant isolate 20CDJ6, respectively. (A) Protective effect of fungicides in experiments inoculated with a susceptible isolate 20JDS8. (B) Curative effect of fungicides in experiments inoculated with a susceptible isolate 20JDS8. (C) Protective effect of fungicides in experiments inoculated with a resistant isolate 20CDJ6. (D) Curative effect of fungicides in experiments inoculated with a resistant isolate 20CDJ6. 1, untreated control; 2, azoxystronin; 3, trifloxystrobin; 4, kresoxim-methyl.

작용기작이 다른 살균제의 고추탄저병균에 대한 균사생장 억제효과.

Pyraclostrobin 감수성 균주인 C. acutatum s. lat. 20JDS8과 저항성 균주인 20CDJ6을 선발하여 실시한 한천희석법에서 두 균주에 대한 pyraclostrobin의 평균 EC50값은 20JDS8에 대해서 0.1 μ g/ml, 20CDJ6에 대해서 100 μ g/ml 이상으로 뚜렷하게 구분되었다. Pyraclostrobin과 작용기작이 다른 dithianon을 비롯한 5종 살균제의 균사생장 억제효과를 조사한 결과(Fig. 6), 감수성인 20JDS8에 대한 살균제의 EC50값은 dithianon 752.6 μ g/ml, isopyrazam 0.8 μ g/ml, fluazinam 0.1 μ g/ml, tebuconazole 0.2 μ g/ml, prochloraz 0.1 μ g/ml로 나타났으며, 저항성인 20CDJ6에 대해서는 dithianon 657.2 μ g/ml, isopyrazam 2.8 μ g/ml, fluazinam 0.6 μ g/ml, tebuconazole 0.3 μ g/ml, prochloraz 0.1 μ g/ml로 나타났다. 결국 Fig. 6에서 보는 것과 같이 pyraclostrobin 감수성과 저항성인 20JDS8과 20CDJ6은 작용기작이 다른 살균제에 대해서는 모두 감수성인 반응을 보였다. 다만 dithianon의 경우, 20JDS8과 20CDJ6에 대한 효과에 차이는 없었지만, 다른 살균제에 비하여 균사생장 억제효과가 낮았다. 본래 dithianon은 병원균의 균사생장 억제효과보다는 포자발아 억제효과가 우수한 보호살균제로 알려져 있다. 사과에 병을 일으키는 Phlyctema vagabunda에 대해서 10 μ g/ml와 100 μ g/ml로 처리한 dithianon과 difenoconazole의 억제효과를 비교하여 보아도, 보호살균제의 특성을 알 수 있다(Wood와 Fisher, 2017). Dithianon 의 포자발아 억제효과는 10 μg/ml와 100 μg/ml 처리구에서 72.5%와 85.0%이었으나, 균사생장 억제효과는 25.0%와 33.3%이었다. 하지만 치료살균제인 difenoconazole은 동일한 농도 처리구에서 포자발아 억제효과가 0%와 41.3%, 그리고 균사생장 억제효과는 81.7%와 93.3%로, 보호살균제인 dithianon과 반대의 결과를 보여주었다.

Fig. 6

Inhibitory ratio (%) of mycelial growth of Colletotrichum acutatum s. lat. according to several fungicides: (A) dithianon, (B) isopyrazam, (C) pyraclostrobin, (D) fluazinam, (E) tebuconazole, and (F) prochloraz.

고추 열매 상처 접종에서 작용기작이 다른 살균제의 병 방제.

Dithianon, pyraclostrobin, tebuconazole 등은 pyraclostrobin 감수성 고추탄저병균에 대해서 96.4%, 85.3%, 100.0%의 병 방제효과를 보였으며, prochloraz는 50.6%로 3종의 살균제보다는 통계적으로 낮은 방제효과를 보였다(Fig. 7). Isopyrazam과 fluazinam 의 방제효과도 8.9%와 26.8%로 통계적으로 낮은 효과를 보였다. 저항성 균주인 20CDJ6에 대해서 pyraclostrobin 18.0%의 효과를 보였는데, dithianon, tebuconazole, prochloraz는 76.9%, 82.7%, 68.7%의 효과를, isopyrazam과 fluazinam은 5.2%와 24.1%의 낮은 효과를 보였다. Fig. 8에서도 pyraclostrobin은 감수성 균주를 접종한 열매에서 우수한 방제 효과를 확인할 수 있었지만, 저항성 균주를 접종한 경우에는 무처리구와 비슷한 병 발생을 보였다. 감수성 균주인 20JDS8과 저항성 균주인 20CDJ6 모두에 대해서 dithianon은 예방효과가 우수하였으나, tebuconazole은 예방효과와 치료효과 모두가 우수하였다. 감수성과 저항성 균주 모두에 대해서 우수한 균사생장 억제효과를 보였던 fluazinam은 상처 첩종 결과 감수성균과 저항성균 모두에 대해서 저조한 병 방제 효과를 보였다.

Fig. 7

Effect of fungicides on pepper anthracnose caused by Colletotrichum acutatum s. lat. 20JDS8 and 20CDJ6. This experiment was performed using the pepper fruits. When inoculating pathogens, 20JDS8, a pyraclostrobin-sensitive isolate, and 20CDJ6, a resistant isolate, were inoculated on pepper fruits by an wounding method, respectively. The difference between each treatment was tested by Duncan for protective and curative effects, respectively. Values labeled with the same letter are not significantly different in Duncan's multiple range test at P=0.05.

Fig. 8

Controlling efficacy of fungicides on pepper anthracnose caused by Colletotrichum acutatum s. lat. on fruits inoculated with 20JDS8 as a pyraclostrobin-sensitive isolate (A) and 20CDJ6 as a resistant isolate (B), respectively.

고추 열매 무상처 접종에서 작용기작이 다른 살균제의 병 방제.

감수성 균주인 20JDS8을 무상처 분무 접종하고 조사한 dithianon, pyraclostrobin, fluazinam, tebuconazole, prochloraz의 병 방제 효과는 각각 75.7%, 51.4%, 95.4%, 91.9%, 100.0%, 89.2%이었다(Fig. 9). 하지만 고추 열매에 병원균을 접종하고 1일 후에 살균제를 처리한 치료 효과 검정에서는 pyraclostrobin의 효과가 76.5%, tebuconazole과 prochloraz의 효과는 85.2%와 79.6%로 우수한 효과를 보였다. 하지만 dithianon은 22.2%로, fluazinam 은 0%로 예방 효과에 비하여 치료 효과가 매우 저조하였다. 저항성 균주 20CDJ6을 접종원으로 사용하여 예방 효과를 조사한 결과, dithianon, fluazinam, tebuconazole, prochloraz의 효과는 각각 49.2%, 88.1%, 98.3%, 98.3%이었으나, pyraclostrobin 은 11.9%로 낮은 효과를 나타냈다. 치료 효과는 tebuconazole과 prochloraz가 88.9%로 높은 효과를 보였으며, dithianon, pyraclostrobin, fluazinam은 22.2%, 5.6%, 2.2%로 저조하였다.

Fig. 9

Protective and curative effect of fungicides against pepper anthracnose. Fungicides were sprayed before and after inoculation of pathogens. As an inoculum, Colletotrichum acutatum s. lat. 20JDS8 (A) as a pyraclostrobin-sensitive isolate and C. acutatum s. lat. 20CDJ6 (B) as a resistant isolate were inoculated, respectively. The difference between each treatment was tested by Duncan for protective and curative effects, respectively. Values labeled with the same letter are not significantly different in Duncan's multiple range test at P=0.05. Di, di-thianon; I, isopyrazam; Py, pyraclostrobin; Fa, fluazinam; Te, tebuconazole; Pr, prochloraz.

고추 탄저병의 방제용으로 등록되지 않은 isopyrazam은 병원균의 숙신산탈수소 효소의 활성을 저해하는 것으로 알려져 있다(Harp 등, 2011). 본 실험에서 isopyrazam은 배지 상에서 실시한 병원균의 균사생장 억제효과는 우수하였지만, 고추 열매에 병원균을 상처나 무상처 접종하고 조사한 병 방제 효과는 모두 저조하여 실제 포장에서 탄저병을 방제하기에는 어려울 것으로 생각한다.

Fluazinam은 병원균의 미토콘드리아에서 ATP 합성을 저해하는 작용기작을 가지고 있으며(Vitoratos, 2014), 오이에 갈색무늬병을 일으키는 Corynespora cassiicola에 대해서는 우수한 균사생장과 포자발아 억제효과를 보인다. 오이 잎에 100 μ g/ml fluazinam을 예방 처리하였을 경우 병 방제 효과는 97.5%이었지만, 치료 처리할 경우에는 58.2%로 감소하였다(Li 등, 2020). 본 실험에서도 상처를 내지 않은 열매에 fluazinam을 예방 처리하였을 때에는 효과가 우수하였지만, 치료 처리할 경우에는 효과가 크게 감소하였다. 또한 fluazinam을 처리한 병원균의 포자 현탁액을 고추 열매의 상처 위에 접종할 경우도 방제효과가 26.8%로 매우 낮았다. 하지만 pyraclostrobin 저항성 탄저병균에 대해서도 효과가 우수한 만큼, 고추 탄저병 방제를 시작하는 병 발생 전에 예방 처리할 수 있는 보호살균제로서 사용이 가능할 것으로 생각한다.

본 실험의 결과 pyraclostrobin에 대해서 저항성인 고추탄저병균은 strobilurin계에 속하는 azoxystrobin, trifloxystrobin, kresoxim-methyl에 대해서도 저항성이어서, 동일한 계열에 속하는 살균제 간에 교차저항성 관계가 있음을 보여주었다. Pyraclostrobin과 작용기작이 다른 살균제는 저항성균의 균사 생장을 억제할 뿐만 아니라, 병 방제 효과도 우수하였다. 하지만 숙신산탈수소 효소 활성 억제제인 isopyrazam은 병원균의 균사 생장을 억제하지만, 병 방제 효과가 낮은 관계로 pyraclostrobin의 대체 살균제로 사용은 어려울 것으로 생각한다. 미토콘드리아에서 ATP 합성을 저해하는 fluazinam은 보호살균제처럼 발병전 처리가 가능할 것으로 생각한다. 작용기작이 전혀 다른 tebuconazole과 prochloraz는 감수성균과 저항성균 모두에 대해서 균사생장 억제효과 뿐만 아니라, 예방 및 치료효과도 보이기 때문에 저항성 발생율이 높은 지역에서 발병 전후에 처리할 수 있는 살균제라고 본다.

Notes

Conflicts of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Acknowledgments

This work was supported by the Korean Institute of Plan-ning and Evaluation for Technology in Food, Agriculture, Forestry (IPET) through the Crop Viruses and Pests Response Industry Technology Development Program, funded by the Ministry of Agriculture, Food, and Rural Affairs (MAFRA; Grant No. 320042-5).

References

Bartlett D. W., Clough J. M., Godwin J. R., Hall A. A., Hamer M., Parr-Dobrzanski B.. 2002;The strobilurin fungicides. Pest. Manag. Sci. 58:649–662.
Collina M., Landi L., Guerrini P., Branzanti M. B., Brunelli A.. 2005. QoI resistance of Plasmopara viticola in Italy: biological and quantitative real-time PCR approaches . Modern Fungicides and Antifungal Compounds, IV In : Dehne H. W., Gisi U., Kuck K. H., Russell P. E., Lyr H., eds. p. 81–88. BCPC: Alton, Hants, UK.
Gisi U., Sierotzki H., Cook A., McCaffery A.. 2002;Mechanisms influencing the evolution of resistance to Qo inhibitor fungicides. Pest. Manag. Sci. 58:859–867.
Harp T. L., Godwin J. R., Scalliet G., Walter H., Stalker A. D., Bartlett D. W., et al. 2011;Isopyrazam, a new generation cereal fungicide. Asp. Appl. Biol. 106:113–120.
Heaney S. P., Hall A. A., Davies S. A., Olaya G.. 2000. Resistance to fungicide in the QoI-STAR cross-resistance group: current perspective. Proceeding of the British Crop Protection Conference: Pest and Disease Vol. 2p. 755–762. British Crop Protection Council. Franham, Surrey, UK:
Isa D. A., Ahn S., Park S., Kim H. T.. 2020. Monitoring of resistance of Colletotrichum acutatum causing pepper anthracnose to pyraclostrobin using quantitative sequencing and agar dilution method In: The 2020 KSPP Conference & Special Symposium, The International Year of Plant Health in 2020, p. 83. Korean Society of Platn Pathology, Seoul, Korea.
Ishii H., Fraaije B. A., Sugiyama T., Noguchi K., Nishimura K., Takeda T., et al. 2001;Occurrence and molecular characterization of strobilurin resistance in cucumber powdery mildew and downy mildew. Phytopathology 91:1166–1171.
Kim Y.-S., Dixon E. W., Vincelli P., Farman M. L.. 2003;Field resistance to strobilurin (QoI) fungicides in Pyricularia grisea caused by mutations in the mitochondrial cytochrome b gene. Phytopathology 93:891–900.
Kim A. H., Kim S. B., Han K. D., Kim H. T.. 2014;Monitoring for the resistance of strobilurin fungicide against Botrytis cinerea causing gray mold disease. Korean J. Pestic. Sci. 18:161–167. (In Korean).
Kim J. T., Lee K. H., Min J. Y., Cho I. J., Kang B. K., Park S. W., et al. 2004;Fluctuation of the sensitivity of Colletotrichum spp. causing the red-pepper anthracnose to chlorothalonil. Korean J. Pestic. Sci. 8:231–237. (In Korean).
Kim J. T., Park S.-Y., Choi W., Lee Y.-H., Kim H. T.. 2008;Characterization of Colletotrichum isolates causing anthracnose of pepper in Korea. Plant Pathol. J. 24:17–23.
Kim S., Min J., Kim H. T.. 2019;Occurrence and mechanism of fungicide resistance in Colletotrichum acutatum causing pepper anthracnose against pyraclostrobin. Korean J. Pestic. Sci. 23:202–211. (In Korean).
Li T., Xiu Q., Zhang J., Wang J. X., Duan Y. B., Zhou M. G.. 2020;Pharmacological characteristics and efficacy of fluazinam against Corynespora cassiicola, causing cucumber target spot in greenhouses. Plant Dis. 104:2449–2454.
Ma Z., Felts D., Michailides T. J.. 2003;Resistance to azoxystrobin in Alternaria isolates from pistachio in California. Pestic. Biochem. Physiol. 77:66–74.
Rural Development Administration. 2022. Pesticide safety information system URL https://psis.rda.go.kr/psis/agc/res/agchmReg-istStusLst.ps [1 September 2022].
Sierotzki H., Wullschleger J., Gisi U.. 2000;Point mutation in cytochrome b gene conferring resistance to strobilurin fungicides in Erysiphe graminis f. sp. tritici field isolates. Pestic. Biochem. Physiol. 68:107–112.
Steinfeld U., Sierotzki H., Parisi S., Poirey S., Gisi U.. 2001;Sensitivity of mitochondrial respiration to different inhibitors in. Venturia inaequalis. Pest. Manag. Sci. 57:787–796.
Tudi M., Ruan H. D., Wang L., Lyu J., Sadler R., Connell D., et al. 2021;Agriculture development, pesticide application and its impact on the environment. Int. J. Environ. Res. Public Health 18:1112.
Vitoratos A. G.. 2014;Mode of action and genetic analysis of resistance to fluazinam in. Ustilago maydis. J. Phytopathol. 162:737–746.
Wood P. N., Fisher B. M.. 2017;The effect of fungicides on spore germination, mycelial growth and lesion development of Phlyctema vagabunda (syn: Neofabraea alba) (bull's eye rot of apples). N. Z. Plant Prot. 70:112–119.

Article information Continued

Table 1.

Fungicides and their concentrations used in each test method

Fungicide Test method Concentration μg/ml)
Dithianon Agar dilution method 100, 10, 1, 0.1, 0.01
Pepper fruit method 375
Isopyrazam Agar dilution method 100, 10, 1, 0.1, 0.01
Pepper fruit method 63.75
Pyraclostrobin Agar dilution method 10, 2, 0.4, 0.08, 0.016
Pepper fruit method 67.0
Fluazinam Agar dilution method 100, 10, 1, 0.1, 0.01
Pepper fruit method 250
Tebuconazole Agar dilution method 50, 5, 0.5, 0.05, 0.005
Pepper fruit method 250
Prochloraz Agar dilution method 4, 0.8, 0.16, 0.032, 0.0064
Pepper fruit method 125

Table 2.

Criteria for the disease index on pepper fruit

Disease index Area of lesion on each pepper fruit
0 No disease
1 Less than 25%
2 25% or more to less than 50%
3 50% or more to less than 75%
4 75% or more

Fig. 1

Mycelial growth inhibiting ratio (%) of Colletotrichum acutatum s. lat. 20JDS8 (A) and 20CDJ6 (B) causing pepper anthracnose in PDA treated with fungicides. Isolate 20 JDS8 was sensitive to pyraclostrobin, and 20CDJ6 was resistant. The inhibition rate was investigated by agar dilution method on potato dextrose agar (PDA) medium. After incubating the medium inoculated with the pathogen for 5 to 7 days in a dark condition at 25°C, when the diameter of the colony became about 40 mm in PDA treated without any fungicides, the colony diameter of C. acutatum s. lat. was measured, and the mycelial growth inhibition rate (%) was calculated.

Fig. 2

Disease control efficacy of pyraclostrobin on Colletotrichum acutatum s. lat. 20JDS8 and 20CDJ6 causing pepper anthracnose in an wound inoculation experiment. Isolate 20 JDS8 was sensitive to pyraclostrobin, and 20CDJ6 was resistant. (A) The disease control efficacy calculated with the lesion length of the fungicide-applied treatment versus the lesion length of the non-pyraclostrobin-ap-plied treatment. (B) The lesions that occurred when C. acutatum s. lat. 20JDS8 and 20CDJ6 were inoculated on untreated and treated peppers with pyraclostrobin, respectively.

Fig. 3

Protective and curative effects of pyraclostrobin against the susceptible isolate 20JDS8 and resistant isolate 20CDJ6 of Colletotrichum acutatum s. lat. in a non-wound inoculation experiment. (A) The disease control efficacy calculated with the disease incidence on a pepper fruit. (B) The lesions that occurred when C. acutatum s. lat. 20JDS8 (B-1 and B-2) and 20CDJ6 (B-3 and B-4) were inoculated by spraying spore suspensions on unwound pepper fruits. Pyraclostrobin was treated before (B-1 and B-3) and after (B-2 and B-4) inoculation. In all photos, the left side is the pepper fruit not treated with pyraclostrobin, and the right side shows the pepper fruit treated with pyraclostrobin.

Fig. 4

Effect of fungicides used as preventive and curative application on pepper fruits sprayed with conidial suspension of Colletotrichum acutatum s. lat. 20JDS8 (A) and 20CDJ6 (B). The difference between each treatment was tested by Duncan for protective and curative effects, respectively. Values labeled with the same letter are not significantly different in Duncan's multiple range test at P=0.05.

Fig. 5

Control effect of 3 fungicides on pepper anthracnose caused by Colletotrichum acutatum s. lat. Diluted with a field dilution fold, 3 fungicides were applied before and after inoculation with a susceptible isolate 20JDS8 and a resistant isolate 20CDJ6, respectively. (A) Protective effect of fungicides in experiments inoculated with a susceptible isolate 20JDS8. (B) Curative effect of fungicides in experiments inoculated with a susceptible isolate 20JDS8. (C) Protective effect of fungicides in experiments inoculated with a resistant isolate 20CDJ6. (D) Curative effect of fungicides in experiments inoculated with a resistant isolate 20CDJ6. 1, untreated control; 2, azoxystronin; 3, trifloxystrobin; 4, kresoxim-methyl.

Fig. 6

Inhibitory ratio (%) of mycelial growth of Colletotrichum acutatum s. lat. according to several fungicides: (A) dithianon, (B) isopyrazam, (C) pyraclostrobin, (D) fluazinam, (E) tebuconazole, and (F) prochloraz.

Fig. 7

Effect of fungicides on pepper anthracnose caused by Colletotrichum acutatum s. lat. 20JDS8 and 20CDJ6. This experiment was performed using the pepper fruits. When inoculating pathogens, 20JDS8, a pyraclostrobin-sensitive isolate, and 20CDJ6, a resistant isolate, were inoculated on pepper fruits by an wounding method, respectively. The difference between each treatment was tested by Duncan for protective and curative effects, respectively. Values labeled with the same letter are not significantly different in Duncan's multiple range test at P=0.05.

Fig. 8

Controlling efficacy of fungicides on pepper anthracnose caused by Colletotrichum acutatum s. lat. on fruits inoculated with 20JDS8 as a pyraclostrobin-sensitive isolate (A) and 20CDJ6 as a resistant isolate (B), respectively.

Fig. 9

Protective and curative effect of fungicides against pepper anthracnose. Fungicides were sprayed before and after inoculation of pathogens. As an inoculum, Colletotrichum acutatum s. lat. 20JDS8 (A) as a pyraclostrobin-sensitive isolate and C. acutatum s. lat. 20CDJ6 (B) as a resistant isolate were inoculated, respectively. The difference between each treatment was tested by Duncan for protective and curative effects, respectively. Values labeled with the same letter are not significantly different in Duncan's multiple range test at P=0.05. Di, di-thianon; I, isopyrazam; Py, pyraclostrobin; Fa, fluazinam; Te, tebuconazole; Pr, prochloraz.