*Corresponding author 서 론
과수 화상병은 Erwinia amylovora 세균에 의하여 사과, 배, 살구, 자두, 비파, 모과 등 장미과 40속 200여 종에서 발병되는 것으로 알려져 있다(Végh와 Palkovics, 2013). 화상병은 식물의 잎, 꽃, 가지, 줄기, 과일 등의 조직이 흑갈색으로 마르는 특징을 보이며, 증상이 악화되면 나무 줄기나 굵은 가지 등에 궤양을 생성하여 나무의 뿌리까지 고사되어 끝내 나무 전체를 고사시키는 식물세균병이다(Billing, 2011).
화상병은 1780년 미국 동부에서 처음 보고된 이후 지중해, 유럽, 캐나다, 뉴질랜드, 최근에는 중국 인근 중앙아시아까지 확산되었다(Bonn와 van der Zwet, 2000; Drenova 등, 2012). 우리나라에서는 2015년 경기도 안성의 배 과원에서 처음 발견되었으며(Myung 등, 2016), 이후 화상병이 전국으로 확산되어 2022년 기준 4개 도, 28개 시군에서 총 1,044 ha 면적에 발생되었다. 화상병은 전염성이 강해 방치할 경우 과수원 전체에 전염되어 큰 경제적 손실을 초래할 수 있어, 정부는 발병주를 중심으로 일정 거리 내의 모든 기주식물을 제거하는 공적 방제를 시행하고 있다(Lee 등, 2018; Park 등, 2023). 특히 충청북도에서는 2022년 536 ha에 발생하여 인근 과원을 포함해 총 559 ha를 매몰하였다.
과수 화상병은 아직까지 뚜렷한 치료 약제가 없는 실정으로(Gildemacher 등, 2006), 국내에서는 예찰과 방제만으로 화상병의 감염 확산을 예방하고 있다. 반면, 국외에서는 화상병 발생 및 확산 위험을 감소시키기 위한 방안으로 저항성 품종의 도입이 중요시되고 있으며, 저항성이 높은 사과 품종의 재배가 지속 가능한 전략으로 보고되어 있다(Sedlak 등, 2015; Sobiczewski 등, 2015). 미국에서는 농가에 화상병 저항성 품종의 재배를 권장하며 일반 방제를 시행하고 있고(Rodoni 등, 2006; Russo 등, 2007), 과수 화상병 저항성 대목을 이용하여 발생을 억제하는 노력도 지속되고 있다. 대목은 보통 왜화도, 조기결실성, 내동성 등에 영향을 미칠 뿐 아니라, 내병성에도 효과가 있는 것으로 보고되었다(Fallahi 등, 2002). 특히 대목은 접수의 화상병 저항성에 상당한 영향을 줄 수 있으며, 화상병 저항성과 관련된 유전자에 대한 연구 결과 또한 보고되어 있다(Jensen 등, 2012). 이에 따라 효과적인 방제를 위해 저항성 대목 선택이 중요한 전략이 될 수 있다(Norelli 등, 2003).
과수 화상병 저항성 대목으로 미국 Cornell 대학 Geneva 연구소에서 Geneva NY Breeding Program을 통하여 육성된 Geneva 대목이 있다(Robinson 등, 1997). Geneva 대목은 여러 현장 실험을 통해 상업적 표준 대목인 M.9에 비해 화상병에 대한 저항성이 높다는 결과가 많이 보고되었으며(Russo 등, 2007), 미국(Robinson 등, 2003, 2004, 2006, 2011)을 비롯한 캐나다(Moran 등, 2011; Robinson 등, 2007), 뉴질랜드(Robinson 등, 2004; Tustin 등, 2003), 프랑스(Robinson 등, 2004; Simard 등, 2011), 이탈리아(Dallabetta 등, 2018) 등지에서 검토되고 있거나 일부는 이미 농가에서 이용되고 있다. 또한, G.계통 대목은 M.9 또는 M.26과 비슷한 왜화도와 생산성을 보이면서도 화상병 및 역병 저항성, 연작적응성, 내동성 등의 장점이 있어 북미, 유럽에서 평가 및 보급되고 있다.
국외에서는 사과 대목의 기내 식물체와 일반 재배묘를 활용하여 제어된 조건에서 화상병 저항성을 검정하고 평가하는 연구가 활발히 이루어지고 있다. 제어된 기내 조건에서 안전하게 식물 조직에 E. amylovora를 인공적으로 접종하는 방법은 전 세계적으로 널리 사용되고 있다(Abdollahi 등, 2004; Hanke와 Geider, 2002; Hevesi 등, 2011; Kokošková 등, 2010). 특히, 배와 사과 품종의 기내 식물체를 이용해 E. amylovora 저항성을 평가하기 위한 연구 방법이 개발되어 왔으며(Abdollahi 등, 2004; Chevreau 등, 1998; Duron 등, 1987; Paprstein 등, 2011), 사과 품종별 화상병 저항성을 평가하기 위해 다양한 배양 배지의 적용 가능성과 인공 접종 방법에 대한 연구도 수행되었다(Sedlak 등, 2015). 기내 식물체에서 신초 끝을 절단하여 접종하는 등 다양한 화상병 저항성 검정 방법이 제안되었으나, 배양병 내에서 접종을 진행해야 한다는 제한점이 존재한다. 따라서 보다 효율적인 접종 방법을 개발하고, 접종 후 저항성을 평가할 최적의 시점을 구명하여 저항성 차이를 명확히 드러낼 수 있는 구체적인 검정 방법의 확립이 필요하다. 또한, 기내 식물체뿐만 아니라 사과 대목의 일반 재배묘를 활용하여 온실 내에서 E. amylovora 의 여러 균주별 접종 시험을 통해 저항성 정도를 비교한 연구 결과가 보고되어 있어(Norelli 등, 2003), 이 접종 방법을 활용하여 대목별 저항성 차이를 비교하고자 하였다.
국내에서 주로 사용되고 있는 사과 대목인 M.9와 M.26은 사과나무 화상병에 매우 취약하여 화상병 확산을 감소시키기 위해 화상병 저항성 대목으로 교체할 필요성이 제기되고 있다. 국외에서는 화상병 저항성 대목에 대한 연구가 활발히 진행되어 왔지만, 국내 환경과 품종에 적합한 저항성 대목 연구는 부족한 상황으로, 대목별 과수 화상병 저항성 검정 연구를 통해 기존 대목의 취약성을 보완하고 안정적인 방제 전략을 개발하는 것이 절실히 요구된다. 또한, 국내에서 식물방역법 제2조에 따라 과수 화상병은 검역 병해충으로 지정된 금지병(검역병)으로 실외에서 화상병 저항성에 대한 연구는 제한적이다. 따라서 본 연구는 통제된 실험실 내에서 기내 식물체와 기내 식물체를 순화하여 외부 환경에서 적응시킨 순화묘를 이용하여 E. amylovora의 인공 접종 후 대목별 화상병 저항성을 평가하고, 저항성 검정을 위한 최적 조건을 구명하여 과수 산업에 필요한 실용적인 자료를 제공하고자 한다.
재료 및 방법
식물체 준비.
기내 식물체는 사과나무 화상병 저항성 대목 인 G.11, G.30, G.41, G.202, G.210과 감수성 대목인 M.9를 실험에 사용하였다(Table 1). 기내 식물체는 대목의 액아로부터 생장점을 채취하고 채취한 생장점을 신초형성 배지에 치상하여 명배양 조건(23±2 o C, light/dark; 16 hr/8 hr, 40 µmol·m-2)에서 8주간 배양하였다. 신초형성 배지는 식물의 조직배양 시 기본 배지로 널리 사용되는 Murashige & Skoog medium (MS) 배지 4.4 g/l에 ascorbic acid (A4118, MBcell) 0.1 g/l, myo-Inositol 0.1 g/l, 6-benzylaminopurine (BAP) 2.0 mg/l, naphthalene acetic acid 0.05 mg/l, plant preservative mixture (PPM; Plant Cell Technology, Washington, D.C., USA) 1.0 mg/l, sucrose 30.0 g/l, agar 7.7 g/l, gelrite 0.3 g/l를 첨가하여 혼합 제조하였다.
Table 1.
Parentage of the apple rootstocks used in study
| Rootstock | Parentage |
|---|---|
| Geneva 11 | M.26ⅹ Robusta 5 |
| Geneva 30 | Robust 5ⅹ M.9 |
| Geneva 41 | Malling 27ⅹ Robusta 5 |
| Geneva 202 | Malusⅹ domestic cv. |
| Geneva 210 | Ottawa 3ⅹ Robusta 5 |
| M.9 | Selected seedling from ‘jaune de Metz’ a |
이후 유식물체 분화유도용 배지로 옮겨 4주 간격으로 2회 계대 배양 후 완전한 식물체 형성을 유도하였다. 유식물체 분화 유도용 배지는 MS 배지 4.4 g/l에 ascorbic acid 0.10 g/l, myo-Inositol 0.1 g/l, thiamine hydrochloride 0.5 mg/l, BAP 0.5 mg/l, zeatin 0.5 mg/l, indole-3-butyric acid 0.2 mg/l, gibberellic acid 3 0.1 mg/l, PPM (Plant Cell Technology) 1.0 mg/l, sucrose 30.0 g/l, agar 7.7 g/l, gelrite 0.3 g/l를 첨가하여 혼합 제조하였다. 형성된 기내 식물체는 3-4 cm 정도의 길이였으며(Podwyszyń ska 등, 2020), 품종별 15개체씩 준비하여 각 병당 3개체를 배치한 총 5병을 접종 실험에 사용하였다. 준비된 기내 식물체는 평균 8.6-13.9개의 잎을 전개한 상태였다.
순화묘는 과수 화상병 저항성 대목인 G.11, G.30과 감수성 대목인 M.9를 실험에 사용하였다(Table 1). 이전의 연구(Norelli 등, 2003)를 참고하여 접종 전 식물체의 신초를 15 cm 이상 생장시켜 접종하기 적합한 조건으로 준비하고, 품종별 5개체씩 각 접종 실험에 사용되었다.
접종원 준비.
본 시험에서 사용된 Erwinia amylovora 사용 균주는 대목별 화상병 저항성 검정을 위한 접종 실험에 사용할 대표 균주로 농촌진흥청 국립농업과학원(National Institute of Agricultural Sciences)에서 분양받은 국내 화상병 표준 균주인 TS3128을 사용하였다. E. amylovora는 tryptic soy agar 배지에서 배양된 병원균의 colony를 1개 떼어내어 tryptic soy broth 배지에 접종한 뒤, 26 o C와 300 rpm 조건에서 24-48시간 진탕 배양하였다. 이 TS3128 균주를 접종에 사용하였다.
접종 시험을 위한 환경 조건.
접종 시험은 충청북도농업기 술원 생물안전실험실(BL2)에서 진행되었으며, 접종 시 환경 조건은 기내 식물체의 경우, 클린벤치 안에서 접종을 진행하였으며, 실험 전 ultraviolet lamp를 30분 이상 작동시켜 멸균하였고, 클린벤치 내부를 70% 에틸알코올로 소독한 후 진행하였다.
순화묘는 온도 25 o C, 상대습도는 70% 조건에서 접종을 진행하였다. 접종 후 발병 정도를 조사하기 위한 기내 식물체 및 순화묘의 환경 조건은 온도 25 o C, 상대습도 70%로 유지시키고, 일정한 광 조건(light/dark; 16 hr/8 hr)으로 설정하였다.
병원균 접종 및 병 조사.
기내 식물체의 병원균 접종 농도는 1.0×106과 1.0×109 colony forming unit (CFU)/ml이며, shoot 의 꼭대기를 주사기로 찔러 상처를 내고 그 부위에 5 µl의 현탁액을 떨어뜨려 접종하였다. 병 조사는 전체 잎 수 중에서 감염된 잎 수의 백분율인 발병엽률(%)을 조사하였다.
순화묘의 병원균 접종 농도는 1.0×109 CFU/ml이며, 가위에 병원균을 묻혀 신초의 어린 잎 1/2를 비스듬히 절단하는 가위 절단 접종을 하였다(Norelli 등, 2003). 접종 후 암갈색으로 갈변되는 병징을 확인하였고, 병 조사는 전체 잎 수에서 발병된 잎 수의 백분율인 발병엽률(%)을 조사하였다(Roberts 등, 1988). 또한, 병징 발현 유무와 관계없이 대목별 화상병균의 조직 내 확산 정도를 비교하기 위하여 줄기를 3 cm 간격으로 샘플링하여 각 샘플의 DNA 추출, polymerase chain reaction (PCR) 분석 및 전기영동을 통하여 화상병균의 확산 정도를 확인하였다. 화상병균의 확산 정도는 접종 부위를 제외한 E. amylovora가 검출된 길이(cm)를 전체 신초 길이(cm)의 백분율(%)로 측정하였다.
DNA 추출.
먼저, 식물 내부에 존재하는 세균만을 검출하 기 위하여 식물 표면을 70% 에틸알코올로 살균 후 다음 과정을 진행하였다. 화염 살균한 나이프로 수피 겉면을 형성층까지 박피한 후 5×5 mm 이하로 조각내어 1 ml preloaded steel bead tube에 4-5조각을 넣는다. 먼저 넣어둔 750 µl의 lysis buffer에 잘 담기게 뚜껑을 닫고 흔들어주고, tacoPrep 기계를 사용하여 샘플을 연달아 2번 분쇄하였다. 분쇄한 샘플은 5분간 13,000 rpm으로 원심분리 해주었다. DNA 추출 과정은 taco mini Automatic Nucleic Acid Extraction System (GeneReach Biotechnology, Xitun Dist, Taiwan)을 이용하여 동봉된 매뉴얼에 따라 실시하였다.
PCR 분석.
E. amylovora 검출을 위하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응액은 DNA 1 µl, GoTaq G2 Green Mix 25 µl (Promega, Madison, WI, USA), 정방향 및 역방향 프라이머 E. amyA 1 µl 과 E. amyB 1 µl, nuclease free water 22 µl를 넣어 최종 50 µl 가 되게 하였다. E. amylovora의 정방향 및 역방향 프라이머는 A(5′-CGG TTT TTA ACG CTG GG-3′)와 B(5′-GGG CAA ATA CTC GGA TT-3′)로, 이는 pEA29 플라스미드를 표적으로 설계되었다(Bereswill 등, 1992). 그리고 positive control과 negative control로서 E. amylovora TS3128 균액과 nuclease free water 를 1 µl씩 이용하였다. 유전자 증폭은 93oC에서 2분간 initial denaturation 반응 후 denaturation, annealing, extension은 각각 93 o C에서 1분, 52 o C에서 2분, 72 o C에서 2분으로 37회 반복한 후 final extension 70 o C에서 7분간 반응하였다. 또한 Agilent Fragment Analyzer System(자동전기영동장치)을 이용하여 접종 후 20일에 마디별 화상병균의 유무를 확인하였다.
결과 및 고찰
과수 화상병 저항성 대목 기내 식물체 저항성 검정 방법.
사 과 대목 기내 식물체의 효율적인 저항성 검정 방법을 확립하기 위해 저항성 대목으로 알려진 Geneva 대목 5종과 감수성 대목 M.9에 알맞은 접종 방법을 이용해 품종별 저항성 정도를 비교하고자 하였다. Podwyszyń ska 등(2020)은 E. amylovora 세균현탁액에 침지된 메스로 신초 끝을 절단하여 감수성 차이를 비교하였고, Sedlak 등(2015)은 가위로 신초 끝부분을 약 3 mm를 절단한 뒤 피펫을 이용해 절단 부위에 E. amylovora를 3 µl 떨어뜨려 감염을 유도하는 방법이 품종별 감수성 정도를 판별하는 적합한 기술로 보고하였다. 본 실험에서는 배양병 내부의 제한된 공간에서도 접종을 효율적으로 하기 위해 신초 끝을 절단하는 방식 대신 주사기를 사용하여 신초 끝부분을 찔러 상처를 낸 후 피펫으로 일정량의 E. amylovora를 접종하는 방법을 사용하였다. 이 방법은 품종별 병징의 확산 차이를 명확히 구별할 수 있어 저항성 비교에 효과적인 것으로 판단되었다(Table 2).
Table 2.
Comparison of leaf diseased (%) by inoculation of Erwinia amylovora a in in vitro cultured rootstock resistant to fire blight
| Inoculation concentration | In vitro cultured plantlet | Day after inoculation b | |||
|---|---|---|---|---|---|
| 7 | 14 | 21 | 28 | ||
| 1.0×109 CFU/ml | G.11 | 29.6 c c | 062.7 b | 079.3 bc | 100.0 a |
| G.30 | 32.1 c | 066.8 b | 091.2 ab | 100.0 a | |
| G.41 | 54.9 ab | 070.1 b | 087.5 ab | 100.0 a | |
| G.202 | 36.8 c | 058.0 b | 067.5 c | 100.0 a | |
| G.210 | 42.5 bc | 073.0 b | 076.5 bc | 100.0 a | |
| M.9 | 63.4 a | 100.0 a | 100.0 a | 100.0 a | |
| 1.0×106 CFU/ml | G.11 | 00.0 c | 005.0 d | 024.0 c | 037.7 bc |
| G.30 | 07.8 bc | 013.2 cd | 022.0 c | 027.3 c | |
| G.41 | 15.5 ab | 032.8 b | 043.7 b | 051.5 b | |
| G.202 | 11.5 ab | 024.8 bc | 042.3 b | 050.2 b | |
| G.210 | 09.3 bc | 021.4 bcd | 031.6 bc | 046.0 b | |
| M.9 | 20.3 a | 052.8 a | 063.9 a | 071.8 a | |
| Two-way ANOVA | Inoculation concentration (A) | *** d | *** | *** | *** |
| Cultivar (B) | *** | *** | *** | *** | |
| A×B | NS | NS | ** | *** | |
a The in vitro cultured plantlets were inoculated with E. amylovora by creating a wound at the tip of the shoot with a syringe, then applying 5 µl of a suspension with an inoculation concentration of 1.0×109 and 1.0×106 CFU/ml to the wounded area. The incidence of diseased leaves (%) was assessed at 7, 14, 21, and 28 days post-inoculation.
접종 농도에 따른 기내 식물체 대목별 발병엽률(%) 비교 결과.
먼저 접종 농도가 109 CFU/ml일 때, 106 CFU/ml보다 빠르게 감염되어 발병엽률(%)이 높은 편이었으며, 접종 후 7일차에 G.11, G.30, G.202에서 낮은 발병엽률이 관찰되었으나, 이후 모든 저항성 대목에서 감염률이 빠르게 증가하였다(Table 2). 14일차에 M.9는 100% 감염되었고, 감수성 대목인 M.9에 비해 저항성 대목인 Geneva 대목에서 유의하게 발병엽률(%)이 낮아 저항성이 확연히 높았으나, 저항성 대목 간에는 유의한 차이가 없었다(Table 2). 21일차에 G.202 대목의 발병엽률이 가장 낮았고, 그 다음으로 G.210, G.11, G.41, G.30, M.9 순이었다(Table 2). 이때, 저항성 대목 간 유의한 차이가 있었으며, G.30과 G.41의 경우 M.9보다는 유의적으로 발병엽률이 낮았지만, 다른 저항성 대목에 비해 상대적으로 높은 발병엽률을 보였다(Table 2). 그러나 28일차부터 모든 대목이 100% 감염되어 대목 간 저항성 차이를 볼 수 없었으며, 109 CFU/ml 농도로 접종하였을 때 모든 대목의 화상병 감염 속도가 빨랐기 때문에 저항성 대목 간 저항성 차이를 확실히 보기 위해서는 접종 농도를 낮춰야 할 것으로 판단되어 접종 농도를 106 CFU/ml로 하여 실험을 진행하였다.
그 결과, 접종 농도가 106 CFU/ml일 때, 109 CFU/ml보다 화상병의 감염 속도가 현저히 느렸고, 접종 후 7일차에서 G.11은 감염이 전혀 일어나지 않은 유일한 대목이었으며, 모든 저항성 대목이 M.9에 비해 유의하게 낮은 발병엽률을 보였다(Table 2). 14일차는 7일차 결과와 동일하게 G.11, G.30, G.210, G.202, G.41, M.9 순으로 발병엽률이 낮았다(Table 2). 21일차와 28일차에서는 M.9 대목에서 각각 63.9%, 71.8%로 가장 높은 발병엽률을 보였고, G.30, G.11, G.210, G.202, G.41 순으로 발병엽률이 유의하게 낮았다(Table 2). 따라서 G.11과 G.30은 다른 대목들에 비해 상대적으로 낮은 발병엽률을 나타내며 높은 저항성을 보였고, G.41, G.202, G.210 대목은 상대적으로 저항성이 낮았다. 이원 분산 분석 결과, 접종 농도(A)와 품종(B)은 발병엽률에 유의미한 영향을 미쳤으며, 접종 후 21일차와 28일차에서는 접종 농도와 품종 간 상호작용 효과(A× B)도 유의미한 것으로 나타났다. 접종 농도가 높을수록 발병엽률이 증가하였으며, 품종 간 발병엽률의 차이는 접종 농도가 낮을 때 더 뚜렷하게 나타났다(Table 2). 특히, M.9 품종은 다른 품종에 비해 낮은 저항성을 보였으며, 이는 접종 농도가 품종별 저항성 평가에 중요한 요인임을 시사한다. 또한 이 결과는 접종 농도와 품종의 상호작용이 시간이 지남에 따라 발병엽률에 미치는 영향을 구체적으로 보여주며, 화상병 저항성 평가와 접종 조건 최적화에 유용한 정보를 제공한다.
기내 식물체 대목별 병 접종 직후의 상태와 감염 진행에 따른 병징을 관찰한 결과(Fig. 1), 접종 농도 109 CFU/ml일 때, 병징이 확산되어 21일차에 M.9에서 잎이 100% 모두 갈변된 것이 확인되었으며(Fig. 1A, C), 대목 간 발병된 정도에 차이가 나타났다. 한편, 접종 농도 106 CFU/ml에서는 28일차 병징에서 접종 농도 109 CFU/ml보다 대목 간 갈변 증상의 차이가 육안으로 더욱 뚜렷하게 관찰되었다(Fig. 1B, D).
Fig. 1.
Symtoms of Erwinia amylovora in in vitro cultured plantlet. (A) Symtoms 0 days after inoculation at 109 CFU/ml; (B) symtoms 0 days after inoculation at 106 CFU/ml; (C) symptoms 21 days after inoculation at 109 CFU/ml; and (D) symptoms 28 days after inoculation at 106 CFU/ml. CFU, colony forming unit.
기내 식물체의 농도별 저항성 결과를 비교한 결과, 109 CFU/ml 농도로 접종 시 7일 간격의 여러 조사 시기 중 21일차에 저항성 대목 간 유의한 차이를 보였으며, 106 CFU/ml 농도의 경우 28일차에 저항성 대목 간 유의한 차이가 명확히 나타났다. 접종 농도 109 CFU/ml의 경우 연약한 조직을 가진 기내 식물체에는 접종 농도가 높아서 모든 대목의 발병 속도가 빨라 21일차에 유의한 차이는 있었지만 대목 간 차이가 크지 않았다. 이는 기내 식물체에서 화상병 접종 시 감수성 품종이 저항성 품종보다 더 높은 병반 비율로 감염이 되었고, 접종 농도가 높을수록 사과 대목의 화상병 발병률이 빠르고 심각한 감염이 발생한다는 결과와 일치한다(Sedlak 등, 2015).
따라서 기내 식물체의 경우, 일반적으로 자연 상태의 식물체보다 더 민감하고, 세포 조직이 연약하기 때문에 109 CFU/ml의 높은 농도는 과도한 병변을 일으켜 실험 결과에 영향을 미칠 수 있으므로, 106 CFU/ml로 접종하는 것이 적절한 병변을 유도하여 저항성 품종과 감수성 품종 간의 차이를 명확하게 관찰할 수 있는 적합한 방법으로 판단되었다. 그러나 이전 연구에서 기내 식물체에 접종 농도 104 CFU/ml과 106 CFU/ml로 접종하였을 때, 106 CFU/ml의 더 높은 농도로 접종하면 모든 품종의 감염률이 급격히 증가하여 104 CFU/ml가 품종 간 저항성을 평가하기에 적합한 농도라는 연구 결과도 있어(Podwyszyń ska 등, 2020), 추후에는 104 CFU/ml로의 접종 시험도 추가적으로 필요할 것으로 보인다. 또한, 접종 농도 106 CFU/ml에서 대목별 화상병 저항성 평가를 하였을 때, G.11과 G.30이 다른 저항성 대목에 비해 높은 저항성을 나타내어 순화묘 실험에서는 G.11, G.30, M.9 대목에 대해서 저항성 비교를 하였다.
과수 화상병 저항성 대목 순화묘 저항성 검정.
사과 대목 순화묘의 품종별 저항성 정도를 비교하기 위해 선행 연구 방법을 참고하여 접종 시험을 진행하였다. Norelli 등(2003)은 가위에 병원균을 묻혀 신초의 어린 잎 1/2를 비스듬히 절단하는 가위 절단 접종을 통해 감염을 유도하여 저항성 정도를 비교하였다. 본 실험에서는 이 접종 방법을 활용하여 가위 절단 접종을 이용하였고, Roberts 등(1988)의 조사 방법에 따라 발병엽률(%)로 저항성 정도를 비교하였다.
저항성 대목 순화묘의 대목별 발병엽률(%) 비교 결과(Table 3), 접종 4일 후에는 M.9 신초의 끝 부분인 접종 부위를 기점으로 아래로 잎이 점점 갈변되면서 발병엽률이 11.4%로 가장 높은 반면, 저항성 대목인 Geneva 대목 모두 전혀 감염되지 않았다. 접종 6일 후에 G.11, G.30, M.9 순으로 발병엽률이 낮았고, 저항성 대목 모두 M.9에 비해 유의적으로 낮은 발병엽률을 보였다(Table 3). 접종 10일 후에는 M.9와 비교할 때, G.11의 발병엽률이 유의하게 낮았고, G.30은 유의한 차이가 없었다(Table 3). 하지만 발병엽률 조사는 육안으로 갈변된 잎을 조사한 것으로, 화상병균에 의한 병징인지 다른 병해충에 의한 피해인지 정확히 판별하기가 어려워 병징 발현 유무와 관계없이 대목별 식물 체의 각 잎에 대한 E. amylovora의 조직 내 확산 정도를 정확히 확인하기 위하여 PCR 분석을 실시하였다(Table 4).
Table 3.
Comparison of leaf diseased (%) by inoculation of Erwinia amylovora a in acclimatizated rootstock resistant to fire blight
| Acclimatizated rootstock | Day after inoculation b | ||
|---|---|---|---|
| 4 | 6 | 10 | |
| G.11 | 00.0 b c | 01.1 b | 27.6 b |
| G.30 | 00.0 b | 04.7 b | 51.8 a |
| M.9 | 11.4 a | 23.7 a | 59.0 a |
a The acclimatized rootstocks were inoculated with E. amylovora by performing scissor-cut inoculation, which involved dipping scissors in the pathogen suspension with a concentration of 1.0×109 colony forming unit/ml and diagonally cutting half of a young leaf on the shoot. The incidence of diseased leaves (%) was assessed at 4, 6, and 10 days post-inoculation.
Table 4.
PCR a-based detection of Erwinia amylovora DNA in segments of inoculated apple rootstocks
| Acclimatizated rootstock | Detection of E. amylovora DNA | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| IS | Each segment of the stem | ||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | ||
| G.11 | + b | - | - | - | - | - | - | - | - |
| G.30 | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| M.9 | + | + | + | + | + | + | + | + | - |
저항성 대목 순화묘에 화상병균 접종 후 20일차에 PCR 분석한 결과, M.9는 조직 내 확산율(%)이 92.1%로 대부분 감염이 되었다(Table 5). G.11과 G.30은 육안으로 잎의 갈변이 관찰되었으나(Fig. 2), G.11은 접종 부위를 제외한 조직에서 화상병균이 검출되지 않았고, G.30은 접종 부위에서도 화상병균이 검출되지 않았다(Table 4). 이는 접종 부위에서 화상병균이 엽맥을 따라 확산하지 못하고 소량으로 존재하여 검출되지 않은 것으로 판단된다. 또한 이 결과는 M.9가 86.4%의 높은 감염률을 보여 화상병에 매우 감수성이 높은 대목인 반면 G.11, G.30 등 저항성 대목의 경우 매우 높은 저항성을 보여 괴사 현상이 거의 없었으며, 특히 G.11의 경우 E2017p 균주에서 0%의 감염률을 나타냈다는 이전 연구 결과와 유사하였다(Norelli 등, 2003). 따라서 발병엽률을 기준으로 한 저항성 비교 결과와 PCR 분석을 통한 조직 내 확산 정도의 결과 간에 차이가 나타났으며, 감염 정도를 잎의 증상으로 판단하는 방법보다는 PCR 분석을 통해 조직 내 확산 정도를 확인하는 것이 보다 정확한 평가 방법으로 판단되었다. 아울러 순화묘의 저항성 정도를 비교하기 위해 Norelli 등(2003)의 조사 방법을 적용하여, 감염된 병반 부위의 길이(cm)를 해당 연도 신초의 전체 길이(cm)에 대한 백분율로 측정하는 추가 실험을 수행하여 순화묘의 저항성 검정 방법을 확립할 필요가 있다.
Fig. 2.
Symtoms of Erwinia amylovora in acclimated rootstock. (A) Symtoms 0 days after inoculation at 109 CFU/ml and (B) symtoms 20 days after inoculation at 109 CFU/ml. CFU, colony forming unit.
Table 5.
Progression of Erwinia amylovora within rootstock tissues
| Acclimatizated rootstock | Progress of E. amylovora within tissues (%) a |
|---|---|
| G.11 | 0.0 |
| G.30 | 0.0 |
| M.9 | 92.1 |
본 연구를 통해 기내 식물체를 대상으로 대목별 저항성을 비교하기 위한 적절한 검정 방법으로, 접종 농도는 106 CFU/ml로 설정하고, 접종 28일 후에 대목별 발병엽률(%)을 조사하는 것을 제안하고자 한다. 또한, 순화묘에서 대목별 저항성 비교 결과, M.9는 92.1%로 감염된 반면, 저항성 대목은 접종 부위를 제외하고 전혀 감염되지 않았다. 이처럼 G.11 등 저항성 대목은 감수성 대목인 M.9에 비해 화상병 저항성 효과가 높아, 화상병 확산 방지를 위한 저항성 대목으로 활용될 가능성을 확인하였다.향후, 저항성 대목에 국내 사과 품종을 접목한 접목묘를 대상으로 한 접종 시험을 통해 대목과 접수 품종 간 조합에 따른 저항성 차이를 규명하는 추가 연구가 필요하다. 더 나아가, 실내 환경에서 수행된 인공 접종 실험의 결과를 보완하기 위해 실외 재배지 조건에서도 대목별 저항성을 평가하는 시험이 요구되며, 이러한 연구는 저항성 대목을 활용한 화상병 방제 전략의 실용화를 위한 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
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