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Res. Plant Dis. 2024;30(4):468-473

Publication date (electronic) : 2024 December 31

doi : https://doi.org/10.5423/RPD.2024.30.4.468

Hyeonheui Ham^1,, Yong Hwan Lee¹, Dong Suk Park²

¹Crop Protection Division, National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration, Wanju 55365, Korea

²Microbial Safety Division, National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration, Wanju 55365, Korea

함현희^1,, 이용환¹, 박동석²

¹국립농업과학원 작물보호과

²국립농업과학원 유해생물과

^*Corresponding author Tel: +82-63-238-3276 Fax: +82-63-238-3838 E-mail: hhham@korea.kr

Received 2024 September 27; Revised 2024 November 21; Accepted 2024 November 23.

Abstract

Trans Abstract

Erwinia pyrifoliae는 그람음성의 식물병원세균으로 사과나무 가지검은마름병의 원인균이다. E. pyrifoliae의 기주는 배나무와 사과나무의 일부 품종으로 알려져 있으며(Kim 등, 2001), 네덜란드와 미국에서는 딸기에서 E. pyrifoliae에 의한 병 발생이 보고되었다(Bonkowski 등, 2024; Wenneker와 Bergsma-Vlami, 2015). 배나무에서 가지검은마름병과 화상병의 병징은 매우 유사하다고 알려져있다(Kim 등, 2001). 가지검은마름병에 걸린 과수의 가지는 검게 마르고 괴사하며 다른 부분의 잎, 줄기, 꽃, 열매 등으로 퍼져 검게 마르게 된다. 또한 잎, 꽃, 미성숙 과실 등에 세균유출액(bacterial ooze)이 맺히는 것이 특징이다(Rhim 등, 1999).

E. pyrifoliae는 한국에서 처음 보고된 병원균으로 1995년 강원도 춘천의 배나무에서 처음 확인된 이래로 최근까지도 꾸준히 발생하고 있다(Choi 등, 2022; Kim 등, 1999). 배나무 가지검은마름병은 현재까지 국내에서만 보고되었으며, 한국산 배 등의 수출 시 E. pyrifoliae는 수입국의 요구에 따라 검역 대상에 포함될 수 있어 정부에서 이를 방제 대상 식물병으로 관리하고 있으며 발병이 확인된 과수는 굴취 및 매몰을 통해 즉시 제거되고 있다(Lee 등, 2023). Erwinia amylovora에 의한 과수 화상병과 E. pyrifoliae에 의한 과수 가지검은마름병은 병징과 병원균의 형태적, 생화학적 특성이 유사하여 초기에는 구별하기가 어려웠으나, 다양한 진단 기술이 개발되면서 현재는 E. amylovora와 E. pyrifoliae를 분자생물학적으로 명확히 구분할 수 있다(Choi 등, 2022; Ham 등, 2022; Jin 등, 2022). 그러나 E. pyrifoliae에 관한 제한적 연구와 유전 정보로 인해 국내 균주의 다양성이나 다른 국가에서의 E. pyrifoliae에 의한 병 발생 원인이 명확히 밝혀지지 못했다. 따라서 E. pyrifoliae의 다양성 연구와 역학 조사를 위해 종내 수준에서 유전형 분석이 필요한 실정이다.

E. pyrifoliae의 유전형을 구분하기 위해 16S-23S internal transcribed spacer region BOX-polymerase chain reaction (PCR)과 플라스미드의 유형을 분석한 연구(Shrestha 등, 2007) 및 electron transport complex subunit RsxC (rsxC) 유전자의 아미노산 반복을 이용한 연구가 수행되었다(Ham과 Park, 2024). 그러나 조사 대상 균주의 분리 시기가 1990년대로 너무 과거이거나 균주의 개수가 적어 지역별 다양성을 확인하기에는 한계가 있었다. 이 중에서 rsxC의 아미노산 반복에 따른 E. pyrifoliae의 유전형 분석은 가장 최근에 밝혀진 방법으로, rsxC를 아미노산으로 번역하였을 때 C-말단 쪽 40개의 아미노산 서열(DPRKAAVAAAVARAKAK-KAAQAAPATAEQAAHAQQPAA/VEQ)이 균주에 따라 0회에서 4회까지 다양하게 반복되는 현상을 이용해 유전형을 구분한 것이다. 이러한 단백질을 암호화하는 아미노산 서열은 유전자 서열에 비해 보존되어 있어 종내 다양성을 연구하는 데 안정적인 정보를 제공한다(Ham과 Park, 2024). 따라서 본 연구에서는 2020-2024년도에 국내에서 분리된 E. pyrifoliae 균주 109종을 대상으로 RsxC의 아미노산 반복을 이용하여 유전적 다양성을 분석하고 지역별 차이를 구명하고자 하였다. 이러한 결과는 국내 사과나무 가지검은마름병의 지역별 발생 특성을 이해하고 병원균의 다양성과 역학 연구를 위한 기초 자료를 제공하는 데 의의가 있다.

가지검은마름병이 의심되는 사과나무 시료의 잎 또는 줄기를 70% 에탄올로 표면소독한 후 병징이 나타난 부분의 가장자리를 5×5 mm 크기로 5조각 채취하고 멸균된 칼날로 채취한 조각을 마쇄한 후 멸균증류수 500 µl에 30분간 침지하였다. 침지액 10 µl 를 tryptic soy agar (TSA; Difco, Sparks, MD, USA)와 King's medium B (KB; Difco)에 각각 획선 도말한 후 27^°C에서 2일간 배양하였고, 대조군으로 E. pyrifoliae YKB12327을 함께 배양하였다. 배양한 콜로니의 모양은 TSA에서는 작고 선명하며, KB에서는 크고 점액성으로 E. pyrifoliae 대조군과 유사한 것을 선발하고 TSA 배지에 2회 더 계대배양하여 순수분리하였다. PCR을 위해 콜로니 1개를 20 µl의 멸균증류수에 풀어 현탁액을 제조하고 template로 사용하였다. 프라이머는 RS24580-205F/R (Ham 등, 2022)을 이용하였으며, 반응액은 콜로니 현탁액 1 µl와 forward 및 reverse 프라이머 각각 10 mM을 AccuPower PCR premix (Bioneer, Daejeon, Korea)에 넣고 멸균증류수로 총 20 µl를 채워 제조하였다. 반응액은 C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 pre-denaturation으로 95^°C에서 5분간 반응시킨 후 95^°C 에서 30초, 61^°C에서 30초, 72^°C에서 30초 반응시키는 것을 35회 반복하였고 final-extension으로 72^°C에서 10분간 반응시켰다. 최종 PCR 산물 5 µl를 DNA loading star (Dyne Bio, Seongnam, Korea) 1 µl와 혼합한 후 1% agarose gel에서 100 voltage로 전기영동을 수행하였고, UV transmission illuminator에서 751 bp 크기의 증폭산물이 나타나는지 확인하였다.

E. pyrifoliae 균주의 유전형 분석을 위하여 genomic DNA 추출은 Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 매뉴얼에 따라 수행하였다. 또한 E. pyrifoliae의 rsxC 유전자를 증폭하기 위해 rsxDCB_F1/R1, rsxDCB_ F2/R2 및 rsxDCB_1191F/R 프라이머를 사용하여 PCR을 수행되었다(Ham과 Park, 2024). PCR 반응액의 조성은 25 ng template DNA, 1× buffer, 0.2 mM dNTP, 4 mM MgCl₂ 및 1.25 units의 GoTaq Flexi DNA polymerase (Promega)로 구성하고 멸균증류수를 이용해 최종적으로 25 µl가 되게 하였다. PCR 조건은 pre-denaturation으로 95^°C에서 5분간 반응시키고, 95^°C에서 30초, 60^°C (rsxDCB_F1/R1, rsxDCB_F2/R2) 또는 64^°C (rsxDCB_1191F/R)에서 30초, 72^°C에서 1분간 반응시키는 것을 35회 수행한 후, final-extension으로 72^°C에서 10분간 반응시켰다. PCR이 완료된 증폭 산물들은 Bionics (Daejeon, Korea)에 염기서열 분석을 의뢰하였고 결과를 SeqMan 7.2.1 (DNASTAR, Madison, WI, USA)을 이용하여 trimming하였다. 완성된 각각의 rsxC 염기서열을 EditSeq 7.2.1 (DNASTAR)을 이용하여 아미노산으로 번역하고, 40개 아미노산 반복서열이 균주별로 몇 회 반복되는지 조사하였다.

RsxC 유전형에 의한 E. pyrifoliae 균주 간의 유연관계를 분석하기 위해 E. pyrifoliae 균주에서 얻어진 각각의 rsxC 유전자 염기서열은 MAFFT (version 7; Katoh 등, 2019)로 alignment를 수행하였다. 이 때, 동일한 연도와 지역에서 분리된 균주들 중 염기서열이 동일한 경우 최초로 분리한 균주 만을 유연관계도 분석에 사용하였다. 또한 National Center for Biotechnology Information의 genome database에서 reference genome인 EpK1/15와 최근에 게놈 서열이 정확히 밝혀진 YKB12327의 염기서열(Nie 등, 2024)을 분석에 추가하였다. PHYLOViZ (version 2.0; Nascimento 등, 2017)의 goeBURST distance (Feil 등, 2004)를 이용해 최소신장트리를 작성하고 유연관계를 분석하였다.

E. pyrifoliae 균주의 유전형별 분포 지도 작성을 위해 국내 도, 시/군/구 및 읍/면/동의 벡터지도를 국토지리정보원(ngii.go.kr)에서 다운로드받았다. E. pyrifoliae 균주들을 분리한 과수원의 GPS 정보는 구글 지도를 통해 수집하였다. 균주들은 연도, 유전형별로 구분하고 Quantum Geospatial Information System (QGIS, v3.8; Open source Geospatial Foundation, Boston, MA, USA)을 이용하여 분포 지도를 작성하였다.

결과적으로 2020년부터 2024년까지 강원도, 경기도, 경상북도, 충청북도의 18개 시군에서 진단을 의뢰한 사과나무 가지검은마름병 의심 시료에서 총 109개의 E. pyrifoliae 균주를 수집하였다. 수집한 균주들은 모두 가지검은마름병의 증상이 보이는 사과나무의 잎 또는 줄기의 병반에서 분리하였다. 수집한 전체 균주 수는 강원도 고성 2 (2개 과원), 양구 9 (9개 과원), 영월 2 (1개 과원), 원주 4 (3개 과원), 철원 13 (13개 과원), 춘천 9 (6개 과원), 홍천 9 (2개 과원), 화천 4 (4개 과원) 및 횡성 5 (4개 과원) 균주와 경기도 광주 12 (5개 과원), 양평 3 (2개 과원), 연천 1 및 포천 7균주(5개 과원), 경상북도 문경 1, 영주 7 (5개 과원) 및 울진 1균주, 충북 충주 18 (13개 과원) 및 음성 2균주(2개 과원)로 구성되었다.

분리한 균주들의 RsxC 유전형은 아미노산 반복이 1개(Rsx-1) 존재하는 균주가 4종, 2개(Rsx-2) 존재하는 균주가 87종 및 4개(Rsx-4) 존재하는 균주가 18종으로 Rsx-2 유형이 가장 많은 비율을 차지하였다. 이 중에서 Rsx-1 유형은 경상북도 영주와 울진에서만 발견되었다(Table 1). Rsx-2 유형은 충주 앙성면에서 18균주가 분리되어 가장 많은 비율을 차지하였으며, 강원도 철원과 경기 광주에서도 각각 12균주가 분리되어 두 번째로 많은 비중을 차지하였다. Rsx-4 유형은 춘천에서 5균주가 분리되어 가장 비율이 높았고 다른 지역에서는 2개 또는 1개 균주가 분리되었다.

Table 1.

Number of 40-amino acid repeats in RsxC (DPRKAAVAAAVARAKAKKAAQAAPATAEQAAHAQQPAA/VEQ) in the bacterial isolates used in this study

이를 종합하면 국내에서 분리된 E. pyrifoliae 균주들은 3가지 유전형으로 구분되었고 영주/울진에서 나타나는 Rsx-1 유형과 가장 우점하는 유전형인 Rsx-2 유형 및 춘천에서 주로 나타나는 Rsx-4 유형이 확인되었다. 세 가지 유형이 모두 나타나는 지역은 경북 영주였으며, Rsx-2와 Rsx-4 형이 동시에 나타나는 지역은 강원도 양구, 철원, 춘천, 화천, 횡성 및 경기도 포천으로 확인되었다.

E. pyrifoliae 균주들의 rsxC 유전자 염기서열을 이용하여 최소신장트리를 작성한 결과 E. pyrifoliae YKB12327(포천, 2015년 분리, Rsx-2)을 중심으로 1_CB-CJ-2020(충주, 2020, Rsx-2)과 6_ GG-GJ-2021(광주, 2021, Rsx-2) 및 Epk1/15(포천, 2014, Rsx-4)로 나뉘었다(Fig. 1). 1_CB-CJ-2020과 6_GG-GJ-2021은 모두 Rsx-2 유형이었으며 YKB12327을 포함한 6_GG-GJ-2021과 그 하위 그룹은 RsxC의 아미노산 서열 645-646번 위치에 “ RA”가 존재하였고 1_CB-CJ-2020와 그 하위 그룹은 “ RA”가 존재하지 않았다(Fig. 2). Fig. 2의 아미노산 서열은 40개의 아미노산 반복이 완료된 바로 다음 서열부터 C-말단까지 나타낸 것으로, “ RA”의 유무로 E. pyrifoliae 균주들이 최소신장트리를 통해 구분되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 Rsx-1 유형인 102_GB-YJ-2020(영주, 2020년 분리)은 1_CB-CJ-2020과 그 하위 그룹에서 분기되는 것으로 나타났으며 40개 아미노산 반복 뒤쪽에 아미노산 서열 “ RA”를 보유한 것으로 확인되었다.

Fig. 1.

Minimal spanning tree of Erwinia pyrifoliae isolates based on rsxC nucleotide sequence alignment. The tree was generated using goeBURST distance in PHYLOViZ (v2.0). The colored circles indicate the following genotypes: blue circle, Rsx-1 type; green circle, Rsx-2 type; red circle, Rsx-4 type. Isolates to the left of the dotted line lack the amino acid RA, while those on the right contain it.

Fig. 2.

Sequence alignment of RsxC from Erwinia pyrifoliae isolates highlighting differences. The alignment begins at amino acid position 633 in the E. pyrifoliae YKB12327 reference sequence. Sequences were aligned using ClustalW in MEGA-X. The blue-colored box highlights sequential differences between the isolates.

결과적으로 E. pyrifoliae 균주들이 RsxC의 아미노산 반복수에 따라 구분되었고 Rsx-2 유형을 중심으로 Rsx-1과 Rsx-4가 분기된 것을 확인할 수 있었다. 최소신장트리의 가장 중심에 있는 YKB12327 균주가 분리된 포천은 1995년부터 가지검은마름병이 발생해 왔으며 YKB12327과 유연관계가 가까운 6_ GG-GJ-2021 균주는 경기도 광주에서 분리한 것으로 1997년부터 가지검은마름병이 발생한 지역이다(Lee 등, 2023). 따라서 YKB12327을 중심으로 한 Rsx-2형과 아미노산 “ RA”가 결여된 Rsx-2형 및 EpK1/15로 대표되는 Rsx-4형이 분기되었고, 한편으로는 “ RA”가 결여된 Rsx-2형에서 Rsx-1 유형이 분기된 것으로 판단된다. 본 연구에서 사용한 PHYLOViZ 프로그램은 strain 간의 유전자 서열을 이용하여 계통 정보를 시각화해주는 프로그램으로 goeBURST 알고리즘을 사용하여 최소신장트리를 작성하며 이를 통해 작성된 계통도는 strain 간의 분기와 진화 과정을 추정할 수 있는 근거를 제공한다(Nascimento 등, 2017). 따라서 이러한 결과는 E. pyrifoliae가 국내에서 어떻게 진화되었는지 추정할 수 있는 기초 자료이다. rsxC는 세균의 전자전달에 관여하는 오페론을 구성하며 아직까지 rsxC의 차이에 따른 세균의 형태적, 생리∙생화학적 특성을 분석한 연구는 없는 실정이다(Ham과 Park, 2024). 따라서 Rsx 반복 유형과 균주의 특성 간 차이를 비교하는 연구가 수행된다면 균주의 유전형과 표현형을 연계하는 실마리를 찾으며, 지역별 병원균의 특성을 이해하고 방제 전략을 세우는 데 도움이 될 것이다.

E. pyrifoliae 균주들의 분리 위치와 분리 연도 및 유전형에 따른 분포 지도를 작성한 결과 경기도, 강원도, 충청북도 및 경상북도가 만나는 경계지역에서 병원균이 주로 분리된 것을 확인하였다(Fig. 3). Rsx-1형은 경북지역에서만 나타났고, Rsx-2형은 강원과 경기 및 충북지역에서 주로 나타났으며, Rsx-4형은 경기 북부와 강원도 및 경북지역에서 분포를 확인하였다. 유전형의 분포는 춘천, 화천, 양구, 횡성, 철원, 포천의 강원도와 경기 북부지역에서 Rsx-2와 Rsx-4형이 동시에 나타나는 경향을 보였으며, 이들 지역은 대부분 1995년부터 현재까지 가지검은마름병이 발생해 왔다(Lee 등, 2023). 2020년에 가지검은마름병이 처음 발생한 음성과 충주 및 2024년에 처음 발생한 울진에서는 한 가지 유전형만 나타났다. 반면 2020년에 가지검은마름병이 처음 발생한 경북 영주에서는 세 가지 유전형이 모두 확인되었다. 또한 병원균이 10균주 이상 분리된 경기 광주와 충북 충주에서는 분리된 균주의 유전형이 모두 Rsx-2형으로 나타나 동일한 계통의 균주가 인접한 과수원으로 확산된 것으로 판단되었다.

Fig. 3.

Distribution of Erwinia pyrifoliae isolates by year, genotype, and isolation frequency in Korea. Rsx-1 genotypes are shown in light blue, Rsx-2 in pink, and Rsx-4 in yellow. Symbols represent isolation years as follows: circle, 2020; square, 2021; triangle, 2022; dia-mond, 2023; pentagon, 2024. The map was generated using QGIS (v3.8). The number of E. pyrifoliae isolates is indicated by a gradient of blue: white (0 isolates), light blue (1 isolate), sky blue (2-5 isolates), blue (6-10 isolates), and dark blue (11-20 isolates).

이를 종합하면, 오래전부터 가지검은마름병이 발생해온 지역에서는 다양한 Rsx 유전형이 공존하며 최근에 가지검은마름병이 발생한 곳은 대부분 한 가지 유전형만 확인되어 다양성이 낮은 것으로 나타났다. RsxC는 E. pyrifoliae 외에도 E. amylovora, Escherichia coli, Acetobacterium woodii 등 다양한 세균에서 발견되며 단백질 구조상 FeS center, flavin 및 NADH-binding 영역으로 구분되어 있는데 C-말단 쪽의 길이가 세균에 따라 다른 것으로 보고되었다(Biegel 등, 2011; Ham과 Park, 2023). RsxC 의 C-말단 차이를 유발하는 요인은 40개의 아미노산이 균주마다 서로 다른 반복수로 존재한다는 것이며, 이것이 세균의 종내 수준에서 유전형을 구분할 수 있는 특성으로 사용될 수 있음이 밝혀졌다(Ham과 Park, 2023, 2024). E. amylovora에서는 Rsx 유형에 따라 북미 지역에서만 발견되는 유형인 Eastern N.A.와 Western N.A. 유형이 전 세계적으로 나타나는 Widely-Prevalent 유형과 구분된다. E. pyrifoliae의 경우 국내에서도 일부지역에 국한되어 나타나고 지역별로 거리가 가깝기 때문에 유전형의 지역별 특이도는 낮았지만, Rsx-1 유형은 경북지역에서만 나타났고 Rsx-2와 Rsx-4 유형은 다양한 지역에서 발견되며 오래 전부터 가지검은마름병이 발생해 온 곳일수록 두 가지 유형이 혼재되어 있는 특성이 있었다.

이러한 결과는 국내 가지검은마름병의 유전적 다양성과 지역적 유전형 분포를 구명하는 기초정보를 제공하고, 병원균의 진화 양상과 이동 경로를 예측할 수 있는 정보를 제공한다. 추가적으로 균주마다 RsxC 유전형과 생물적 특성 및 병이 발생하는 환경과의 상관관계를 구명하는 연구가 수행된다면 앞으로 병의 발생을 예측하고 확산을 차단하는 데 기여할 수 있을 것이다.

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