*Corresponding author 서 론
수선화(Narcissus tazetta)는 구근 화훼류 작물로 상업적 가치가 매우 높으며, 최근에는 암과 치매와 같은 다양한 질환에 의약품으로도 사용되는 등 그 이용 가치가 높아지고 있다(Hong 등, 2007; Masi 등, 2015; Raj 등, 2021). 수선화의 주산지는 네덜란드와 영국이며, 16세기 초부터 재배되었다(Hanks와 Chastagner, 2017; Valouzi 등, 2022). 국내에서는 수선화 구근을 네덜란드에서 주로 수입하여 재배하고 있으며(Hong 등, 2007), 농식품수출정보(Korea Agricultural Trade Information; https://www.kati.net/statistics/periodPerformance.do)에 따르면 그 수입액은 2013년 약 2억 원에서 2023년 11억 원으로 지난 10년간 5배 이상 증가하였다.
전 세계적으로 수선화에는 narcissus late season yellows virus (NLSYV), narcissus mosaic virus (NMV) 및 narcissus yellow stripe virus (NYSV)를 포함하여 26종의 바이러스가 보고되었으며(Table 1), 특히 NLSYV 및 NYSV와 같은 포티바이러스 속 바이러스들은 진딧물을 통하여 수선화에 복합 감염되어 상품성을 크게 떨어트린다(Probowati 등, 2022; Raj 등, 2021). ‘한국식물병명목록 6판’에 따르면 국내 수선화에서 보고된 바이러스는 NMV와 tobacco rattle virus 2종이며(The Korean Society of Plant Pathology, 2022), 그 외 국내 수선화에 발생하는 바이러스의 전체적인 감염 실태에 대해서는 알려진 바가 없다. 국내에서는 수선화 구근의 국경검역 과정에서 검역바이러스 6종(arabis mosaic virus [ArMV], raspberry ringspot virus [RpRSV], strawberry latent ringspot virus [SLRSV], tobacco ringspot virus [TRSV], tomato black ring virus [TBRV], tomato ringspot virus [ToRSV])을 대상으로 의무검사를 수행하고 있으며(Animal and Plant Quarantine Agency, 2022), 2021-2022년 동안 3종 바이러스(ArMV, SLRSV, TBRV)가 검출되어 식물위생조치로 수선화 구근을 폐기하였다(Animal and Plant Quarantine Agency, 2012-2022). 이로 볼 때 국내에서는 수선화 구근의 검역 과정에서 일부의 바이러스만을 검사하고 있으며, 세계적으로 수선화에 피해를 일으키는 다양한 바이러스에 대한 검사로는 미흡한 실정이다. 그리하여 국내 수선화 농가는 다수의 바이러스가 감염된 구근을 수입하여 재배하고 있을 것으로 추정되며, 그 경제적 피해가 매우 클 것으로 예상된다.
Table 1.
Viruses reported in Narcissus tazzeta and quarantine pests on bulbs imported to Korea
| Genus | Species | Reference |
|---|---|---|
| Carlavirus | Carnation latent virus | Sastry et al. |
| Narcissus common latent virus | Sastry et al. | |
| Nerine latent virus | Sastry et al. | |
| Cucumovirus | Cucumber mosaic virus | Iwaki and Komuro, Sastry et al. |
| Fabavirus | Broad bean wilt virus | Iwaki and Komuro, Sastry et al. |
| Macluravirus | Narcissus latent virus | Gao et al., Ohshima et al., Probowati et al. |
| Necrovirus | Tobacco necrosis virus | Sastry et al. |
| Nepovirus | Arabis mosaic virusa,c | Sastry et al. |
| Raspberry ringspot virusa | Sastry et al. | |
| Tobacco ringspot virusa | Sastry et al. | |
| Tomato black ring virusa,c | Sastry et al. | |
| Tomato ringspot virusa | Sastry et al. | |
| Polerovirus | Turnip yellows virus | Forde et al. |
| Potexvirus | Narcissus mosaic virusb | Miglino et al., Sastry et al. |
| Potyvirus | Bean yellow mosaic virus | Sastry et al. |
| Cyrtanthus elatus virus A | Kumar et al., Probowati et al. | |
| Lily mottle virus | Liu et al., Sastry et al. | |
| Narcissus degeneration virus | Ohshima et al., He et al., Probowati et al. | |
| Narcissus late season yellows virus | Wylie et al., He et al., Probowati et al. | |
| Narcissus yellow stripe virus | Wylie et al., He et al., Probowati et al. | |
| Ornithogalum mosaic virus | Sastry et al., Probowati et al. | |
| Onion yellow dwarf virus | Sastry et al. | |
| Snowdrop virus Y | Forde et al. | |
| Tobravirus | Tobacco rattle virusb | Iwaki and Komuro, Sastry et al. |
| Unsigned | Narcissus tip necrosis virus | Sastry et al. |
| Strawberry latent ringspot virusa,c | Bellardi and Gelli, Sastry et al. |
26 species of viruses belonging to 10 genus and 2 unsigned genus have been reported in Narcissus tazzeta.
a Quarantine pests on bulbs of Narcissus tazzeta imported to Korea (Animal and Plant Quarantine Agency, 2022).
b Viruses reported in Narcissus tazzeta in Korea on the List of Plant Diseases in Korea 6th Edition (The Korean Society of Plant Pathology, 2022).
c Viruses detected in bulbs of Narcissus tazzeta imported to Korea according to the Year Book of Plant Quarantine Statistics (Animal and Plant Quarantine Agency, 2012-2022).
이러한 배경에서 국내 수선화에 발생하는 바이러스를 탐색하기 위하여 국내 시험포장 및 농가포장에서 다양한 이상 증상이 나타나는 시료를 채집하여 메타전사체 분석 및 reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) 진단을 실시하였다. 이러한 연구에서 국내 수선화에서 snowdrop virus Y (SVY)의 발생을 확인하였다. 본 논문에서는 국내 수선화에서 검출된 SVY의 감염 실태, 전체 염기서열 분석, 전자현미경 검경 및 생물검정을 통하여 SVY를 동정하고자 하였다.
재료 및 방법
수선화 바이러스 감염 시료 채집.
2021년 5월 예산에 위치한 충청남도 농업기술원 화훼연구소 시험포장과 강원도 원주, 경상남도 거제 그리고 전라남도 신안 농가포장에서 줄무늬, 모자이크, 위축, 잎 말림 또는 뒤틀림 등 바이러스 병징으로 보이는 이상 증상이 나타난 수선화 시료 75점을 채집하였다. 예산 시험포장에서는 5개 품종(‘러브콜’, ‘리플리트’, ‘테테아테테’, ‘타이티’, ‘케이타브르’)에서 10점의 시료를 채집하였으며, 3개 농가포장에서는 5개 품종(‘리플리트’, ‘고블렛’, ‘타이티’, ‘살로우’, ‘엘리치어’)에서 56점과 미확인품종 시료 9점을 채집하였다.
수선화 메타전사체 분석.
채집한 수선화 시료에서 바이러스를 탐색하고자, Illumina HiSeq2000 sequencer (Macrogen, Seoul, Korea)를 통하여 메타전사체 분석을 수행하였다. Bak 등(2023)이 수행한 방법에 따라, 수선화 75점 각각의 잎을 약 10 mg 씩을 채취하여 하나의 검체로 집단화(pooling)한 후, 유발·유봉과 액체질소를 이용하여 마쇄하였다. Maxwell® 16 LEV Plant RNA Kit (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 집단화한 시료에서 전체 RNA를 추출하였다. 추출한 전체 RNA는 마크로젠(Seoul, Korea)에 의뢰하여 메타전사체 분석을 수행하였다. TruSeq Stranded Total RNA LT Sample Prep Kit for Plant (Illumina, San Diego, CA, USA) 장비를 사용하여 100 bp paired-end sequencing으로 미가공 데이터(raw-data)를 생산하였다. 생산된 데이터는 Trinity 프로그램(trinityrnaseq_r20140717)의 de novo transcriptome assembly를 사용하여 컨티그(contig)로 조립되었다. Lee 등(2023)이 수행한 방법에 따라, DIAMOND 프로그램의 공공 생물정보 데이터베이스(Gene ontology [version v20180319], UniProt [version 20180116], National Center for Biotechnology Information [NCBI] non-redundant protein [version 20180503], Pfam [version 20160316], EggNOG [version eggnog4], NCBI nucleotide [verision 20180116], Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes [version 20190104])를 기반으로 한 BLASTn 및 BLASTx 분석(E-value 기준값: 1.0E-5)으로 식물바이러스와 관련된 컨티그들을 확보하였다. 본 연구에서는 메타전사체 분석으로 수선화에서 검출된 SVY에 대하여 전체 염기서열 및 특성을 분석하였다.
전체 RNA 추출 및 SVY RT-PCR 진단.
전체 RNA는 Easy-spinTM (DNA free) Total RNA Extraction Kit (iNtRON Biotechnology, Daejeon, Korea)를 이용하여 제조사의 권장 방법에 따라 추출하였다. SVY RT-PCR 진단을 위하여 NCBI GenBank 에 기보고된 SVY 분리주(accession nos. OP871788, EU927399 및 MH886519)와 메타전사체 분석으로 검출된 컨티그 염기서열을 기반으로 외피단백질(coat protein, CP) 영역의 일부 서열을 포함하는 증폭산물을 확보할 수 있는 프라이머를 설계하였다(정방향 프라이머: 5'-CTCAACGGGACAGGGACATC-3', 역방향 프라이머: 5'-GAAGGGGAAGATGCAGCAG-3'). RT-PCR 반응액은 SuPrimeScript RT-PCR Premix 2X (GeNetBio, Daejeon, Korea) 10 μ l, 전체 RNA 1 μ l, 정방향 및 역방향 프라이머 각 1 μ l (10 pmol/μ l) 그리고 증류수 7 μ l를 혼합하여 20 μ l로 조제하여 one-step RT-PCR을 실시하였다. 역전사(RT) 과정은 50°C에서 30분 및 95°C에서 2분간 처리하였다. PCR 과정은 95°C에서 30초, 55°C에서 30초, 72°C에서 1분을 35회 반복하고 72°C에서 5분 동안 반응하였다. 전기영동은 0.5× TAE 완충액, 2% 아가로스 겔 및 1 Kb Plus DNA Ladder (BIOFACT, Daejeon, Korea)를 사용하였다. RT-PCR 증폭 산물은 135 V 45분간 전기영동 후, Gel documentation system을 이용하여 반응산물을 확인하였다.
SVY 외피단백질 염기서열 결정.
수선화에 발생한 SVY의 기원과 변이 정도를 판단하기 위하여 SVY 분리주 10개의 외피단백질 유전자 염기서열을 결정하였다. 외피단백질 영역을 증폭하기 위하여 한 쌍(정방향 프라이머: 5'-CGACGATTATGAGCTT-GCAAG-3', 역방향 프라이머: 5'-CGAACTCACTTGCGTTTG-TAG-3')의 프라이머를 사용하였으며, 예상되는 증폭산물의 크기는 1,011 bp이며, 이는 825 bp의 기보고된 외피단백질 유전자 영역을 모두 포함하고 있다. SVY 외피단백질 유전자 영역을 포함하는 RT-PCR 산물은 Expin™ Combo GP (GeneAll, Seoul, Korea)를 이용하여 제조사의 권장 방법으로 정제하였다. Lee 등(2023)의 방법에 따라 정제된 PCR 산물은 All in One™ PCR Cloning Kit (BIOFACT)를 이용하여 클로닝하였으며, universal primer (M13-47F와 M13-48R)를 이용한 PCR을 통하여 PCR 산물의 삽입 여부를 확인하였다. 플라스미드 재조합이 확인된 균주에서 DNA-spin™ Plasmid DNA Purification Kit (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)를 이용하여 제조사의 권장 방법으로 추출한 플라스미드를 바이오니아(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다.
전자현미경 검경.
RT-PCR 진단에서 SVY가 검출된 4점(SA39, SA42, SA60, SA66)의 시료를 direct negative staining 방법(Park 등, 2014)을 이용하여 전자현미경으로 관찰하였다. 수선화 잎 조직을 potassium phosphate buffer (pH 7.0)를 첨가한 후 마쇄한 다음, 폼바막(Formvar film)을 씌운 grid (200 mesh)에 1분 30초 동안 적셨다. 필터페이퍼로 즙액을 제거하고, 2.5% phosphotungstic acid (pH 7.2) 한 방울을 떨어트린 다음 2분간 침지 후 여액을 제거하고, 투과전자현미경(LE0912AB; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰하였다.
생물 검정.
메타전사체 및 RT-PCR 분석을 통하여 검출된 SVY의 생물학적 특성을 규명하기 위하여 19종(Capsicum an-nuum var. grossum, Citrullus lanatus, Chenopodium amaranticolor, C. quinoa, Cucurbita moschata, Cucumis sativus, Datura stramonium, Gomphrena globosa, Lycopersicon esculentum, Nicotiana benthamiana, N. clevelandii, N. glutinosa, N. occidentalis, N. rustica, N. tabacum cv. KY 57, N. tabacum cv. Turkish, Phaseolus vulgaris, Physalis angulata, Vigna unguiculata)의 지표식물과 SVY가 감염되지 않은 수선화에 즙액접종을 실시하였다. 접종원은 SVY가 감염된 수선화 잎 조직을 100배의 0.01 M phosphate buffer (pH 7.0)를 첨가하여 마쇄한 즙액을 사용하였으며, 연마제는 silicon carbide (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)를 이용하였다. SVY의 감염 여부는 접종 3주 후 접종엽과 상엽을 대상으로 RT-PCR 진단으로 확인하였다.
전체 염기서열 결정 및 유연관계 분석.
SVY 분리주 SA66의 전체 염기서열을 결정하기 위하여 5' 및 3' 말단 영역은 rapid amplification of cDNA end polymerase chain reaction (RACE-PCR)을 수행하였으며, 5' 말단에서 3' 말단 안쪽 영역은 Fig. 1A 와 같이 PCR 산물의 염기서열을 결정하였다. RACE-PCR 및 PCR 을 위한 프라이머(Supplementary Table 1)는 반응 산물의 양쪽 끝이 서로 겹치도록 설계하였으며, Fig. 1A와 같은 방법으로 결정한 15개 염기서열을 조합하여 최종적으로 전체 염기서열을 결정하였다.
Fig. 1.
Schematic representation of the genome organization of snowdrop virus Y (SVY) isolate SA66. (A) The schematic representation of the locations of amplified fragments for determining the complete genome sequence of SVY isolate SA66. (B) The schematic representation of the genome organization of SVY isolate SA66 (accession no. LC757029) showing the polyprotein and the mature protein products. The complete genome of SVY isolate SA66 comprised of 10,560 nucleotides. Amino acid sequences above each part of the mature protein indicate proteolytic cleavage sites. The numbers below the mature protein represent the first to last nucleotide position of the open reading frame (ORF), excluding the poly-A tail. P1, protein 1; HC-Pro, helper component-protease; P3, protein 3; PIPO, pretty interesting Potyviridae ORF; 6K1, 6 KDa peptide 1; CI, cylindrical inclusion protein; 6K2, 6 KDa peptide 2; NIa-VPg, nuclear inclusion A-viral protein genome linked; NIa-Pro, nuclear inclusion A protease; NIb, nuclear inclusion B; CP, coat protein.
RT-PCR은 SuperiorScript III Reverse Transcriptase (Enzynomics, Daejeon, Korea)를 이용하여 수행하였다. RT-PCR 반응액은 5X First strand buffer 4 μ l, 2 mM dNTP mixture 2 μ l, 0.1 M DTT 2 μ l, 전체 RNA template 2 μ l, random N25 primer 1 μ l, SuperiorScript III Reverse Transcriptase 1 μ l 그리고 증류수 6 μ l를 혼합하여 20 μ l 로 조제하였다. 조제한 반응액은 25°C에서 10분간 처리 후, 50°C 에서 1시간, 70°C에서 15분 동안 처리하였다. 합성한 cDNA는 Ez-PCR™ HS 5× Master Mix (ELPIS-BIOTECH, Daejeon, Korea)를 이용하여 PCR하였다. PCR 조건은 95°C에서 2분간 초기 변성 단계를 거친 뒤, 95°C에서 20초, 55°C에서 20초, 72°C에서 1분으로 35회 증폭시켰으며, 마지막으로 72°C에서 5분간 반응하였다.
5' 말단 부위의 염기서열을 결정하기 위하여 RACE-PCR을 수행하였다. 역전사 반응은 gene specific primer (5'-GAC-CACGCGTATCGATGTCGACCCCCCCCCCCCCCCCCD-3')와 SuperiorScript III Reverse Transcriptase를 이용하여 수행하고, ExpinTM Clean up Combo GP Kit를 이용하여 정제하였다. 정제한 cDNA의 5' 말단 부위를 Terminal deoxynucleotidyl transferase (Takara, Shiga, Japan)를 이용하여 G-tailing한 다음, 5' RACE 프라이머(5'-CTCCTAGACAATGAAGGACAG-3')와 oligo dCD anchor 프라이머(5'-GACCACGCGTATCGATGTC-GACCCCCCCCCCCCCCCCCD-3')를 이용하여 PCR을 수행하였다. 또한 3' 말단 부위 염기서열을 결정을 위하여 RACE-PCR을 수행하였다. cDNA는 oligo-dT anchor primer (5'-GACCACGCG-TATCGATGTCGACTTTTTTTTTTTTTTTTV-3')와 SuperiorScript III Reverse Transcriptase를 이용하여 합성하고, ExpinTM Clean up Combo GP Kit를 이용하여 정제하였다. 정제한 cDNA는 3' RACE 프라이머(5'-CTG AAGATATTGACGACAGG-3')와 anchor 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 모든 PCR 산물은 All in One™ PCR Cloning Kit를 이용하여 클로닝하였으며, Lee 등(2023)의 방법에 따라 universal primer (M13-47F와 M13-48R)를 이용한 PCR을 실시하여 PCR 산물의 삽입 여부를 확인하였다. 재조합 플라스미드가 확인된 균주는 DNA-spin™ Plasmid DNA Purification Kit (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)를 이용하여 제조사의 권장 방법으로 플라스미드를 추출하였으며, 이를 바이오니아에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다. 결정한 염기서열은 DNAMAN software ver. 70의 sequence assembly를 이용하여 최종적으로 전체 염기서열로 조합하였다. SVY 전체 염기서열은 Open Reading Frame (ORF) finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)를 이용하여 ORF를 분석하였다.
전체 염기서열을 결정한 SVY 분리주 SA66과 Potyviridae 과에 속하는 바이러스 31종(Potyvirus 17종, Ipomovirus 2종, Macluravirus 2종, Arepavirus 1종, Brambyvirus 1종, Poacevirus 2종, Roymovirus 2종, Rymovirus 2종, Tritimovirus 2종)의 다단백질(polyprotein) 염기서열을 대상으로 Mega11 software ver.11.0.13 (Kumar 등, 2018)를 이용하여 유연관계를 분석하였다. Maximum-likelihood algorithm을 사용하였으며, Jones-Taylor-Thornton 모델을 사용해 추정된 base pair distance matrix에 Neighbor-Joining method 및 BioNJ 알고리즘을 적용한 후 bootstrap을 1,000회 시행하였다.
결 과
메타전사체 분석 및 RT-PCR 진단.
이상 증상을 나타내는 75점의 수선화 시료에서 감염된 바이러스를 탐색하기 위하여 메타전사체 분석을 수행하였으며, 그 결과 약 60 Gbp(총 리드 수: 656,983,494)의 염기서열 정보를 생산하였다. 생산한 데이터는 Trinity 프로그램의 de novo transcriptome assembly를 통하여 96,215개(리드 수: 52,947,665)의 컨티그로 조립되었다. 조립된 컨티그는 DIAMOND 프로그램을 이용하여 공공 생물정보 데이터베이스를 기반으로 BLASTn 및 BLASTx 분석을 수행하였으며, 그 결과 5,951개(리드 수: 23,332,816)의 바이러스 관련 컨티그를 선발하였다. 선발한 컨티그는 개별적인 NCBI BLASTn 및 BLASTx 분석을 추가적으로 수행하였으며, 최종적으로 53개(리드 수: 7,152,249)의 식물바이러스 관련 컨티그를 확보하였다. 이들 중에서 10,552 bp(리드 수: 724,055)의 거의 전체 염기서열에 가까운 SVY 관련 컨티그 1개가 검출되었으며, 이는 NCBI GenBank 등록된 SVY 분리주 4241-SVY-HTS (accession no. OP871788)와 99.7% (10,552/10,554 bp) 뉴클레오타이드 상동성을 나타냈다.
수선화의 SVY 감염 실태.
메타전사체 분석에서 검출된 SVY 의 전체적인 감염 여부를 확인하고자 채집한 수선화 75점 시료에 대하여 개별적인 RT-PCR 진단을 수행하였다(Table 2). 그 결과 SVY는 전라남도 신안 농가포장에서 채집한 수선화 시료 40점 중 10점에서 검출되었다. 그러나 충청남도 농업기술원 예산 소재 화훼연구소 시험포장과 강원도 원주 및 경상남도 거제 농가포장에서 채집한 35점의 시료에서는 검출되지 않았다. SVY가 검출된 신안에서는 채집한 수선화 4개 품종(‘고블렛’, ‘리플리트’, ‘타이티’, ‘살로우’) 모두에서 SVY의 감염을 확인하였다. 세부적으로, ‘고블렛’ 품종은 11점 중 3점, ‘리플리트’는 10점 중 1점, ‘타이티’는 10점 중 2점 그리고 ‘살로우’는 9점 중 4점의 시료에서 SVY가 검출되었다.
Table 2.
SVY 외피단백질 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열 상동성 분석.
수선화에 발생한 SVY의 감염원의 기원과 변이 정도를 판단하기 위하여 10개의 SVY 분리주(SA39, SA40, SA42, SA45, SA48, SA51, SA59, SA60, SA61, SA66)의 외피단백질 유전자 염기서열을 분석하였다. 본 연구에서 염기서열을 결정한 SVY 10개 분리주의 외피단백질 유전자는 모두 825 bp로 확인되었으며, 기보고된 SVY 분리주 3개(accession nos. OP871788, MH886519, EU927399)와 동일하였다. 국내 분리주와 기보고된 SVY 분리주의 외피단백질 상동성은 염기서열이 99.3-99.8%, 아미노산 서열은 98.9-99.6%로 나타났다(Supplementary Table 2). 그리고 국내 SVY 분리주 10개 사이의 외피단백질 염기서열 상동성은 99.5-100%, 아미노산 상동성은 100%로 나타났다.
국내 분리주 10개와 기보고된 3개의 SVY 분리주 간의 외피단백질 영역 아미노산 변이를 Fig. 2에 나타내었다. 모든 SVY 분리주의 외피단백질 영역 아미노산 서열은 274개로 동일하였다. 본 연구에서의 SVY 분리주와 기보고된 분리주의 아미노산 서열을 비교하면, 분리주 OP871788은 외피단백질 영역 26번째 아미노산 서열이 ‘ D’(Aspartic acid)인 반면에, 다른 분리주들은 모두 ‘ N’(Asparagine)으로 확인되었다. 즉, 분리주 OP871788은 274개 아미노산 서열 중 1개가 국내 SVY 분리주와 달라져 아미노산 상동성이 99.6%로 나타났다. 그리고 분리주 MH886519는 외피단백질 영역 22번째 아미노산 서열이 ‘ S’(Serine)인 반면에, 다른 분리주들은 모두 ‘ P’(Proline)로 확인되었다. 또한 분리주 MH886519의 235번째 아미노산 서열은 ‘ T’(Threonine)가 위치하였으나, 다른 분리주들은 모두 ‘ N’(Asparagine)으로 확인되었다. 그리하여 분리주 MH886519는 274개 아미노산 서열 중 2개가 국내 분리주와 달라져 아미노산 상동성이 99.3%로 나타났다. 마지막으로 분리주 EU927399는 외피단백질 영역 245번째 아미노산 서열이 ‘ E’(Glutamic acid)인 반면에, 다른 분리주들은 모두 ‘ K’(Lysine)로 확인되었으며, 274개 아미노산 서열 중 1개가 달라짐로써 국내 분리주와 아미노산 상동성이 99.6%로 나타났다.
Fig. 2.
Alignment of the nucleotide (nt) and amino acid (aa) sequences of coat protein (CP) of the snowdrop virus Y (SVY) isolates. The 10 Korean SVY isolates (SA39, SA40, SA42, SA45, SA48, SA51, SA59, SA60, SA61, and SA66) and another SVY isolates previously registered to National center for biotechnology information (NCBI) data base (accession nos. OP871788, MH886519, and EU927399) were used in the alignment. The aa sequences of CP among Korean SVY isolates were identical. Red text indicates the nt and aa sequences which mutations occurred among SVY isolates. P1, protein 1; HC-Pro, helper component-protease; P3, protein 3; 6K1, 6 KDa peptide 1; CI, cylindrical inclusion protein; 6K2, 6 KDa peptide 2; NIa-VPg, nuclear inclusion A-viral protein genome linked; NIb, nuclear inclusion B; CP, coat protein.
본 연구에서 염기서열을 결정한 10개의 SVY 분리주 외피단백질 염기서열, SA39 (unreleased), SA40 (LC790722), SA42 (unreleased), SA45 (unreleased), SA48 (LC790723), SA51 (unreleased), SA59 (LC790724), SA60 (LC790725), SA61 (unreleased), SA66 (unreleased)은 NCBI GenBank에 등록하였다.
전자현미경 검경.
SVY가 검출된 수선화 잎 시료 4점(SA39, SA42, SA60, SA66)을 전자현미경을 이용하여 바이러스 입자를 관찰하였다. 전자현미경 검경 결과, 4점의 시료 모두에서 전형적인 포티바이러스 입자가 검출되었으며, 복합감염된 다른 사상형 바이러스 입자도 함께 관찰되었다(Fig. 3). 수선화 시료 4점은 RT-PCR 진단에서 SVY뿐만 아니라 다른 사상형 바이러스인 NLSYV (Potyvirus), NeLV (Carlavirus), NMV (Potexvirus)도 함께 검출되었다. 구체적으로, 수선화 시료 SA39와 SA42는 3종 바이러스(SVY, NLSYV, NeLV), 시료 SA60과 SA66은 4종 바이러스(SVY, NLSYV, NeLV, NMV)에 복합감염되어 있었다. 일반적으로 포티바이러스 입자의 길이는 700-900 nm로 관찰되며(Sharma 등, 2014), 본 연구에서도 약 700-900 nm 길이의 사상형 바이러스 입자를 4점의 시료 모두에서 관찰할 수 있었다. 이러한 사상형 바이러스 입자는 포티바이러스인 SVY와 NLSYV 로 추정되며, 이외에 500 nm보다 짧거나 900 nm보다 긴 사상형 바이러스 입자는 각각 NMV 및 NeLV 입자로 판단된다. Loebenstein 등(1995) 및 Probowati 등(2022)에 따르면 대부분의 수선화 구근은 바이러스에 감염되어 있으며, 5종 이상의 바이러스가 복합감염될 수 있다고 주장하였다. 전자현미경 검경으로 수선화에서 관찰된 다양한 사상형 바이러스 입자로 고려해 볼 때, 국내 수선화에도 SVY를 포함하여 다양한 바이러스가 감염되어 있을 것으로 판단된다. SVY가 검출된 수선화의 잎에서 관찰한 생육불량, 황화모자이크, 잎 뒤틀림 그리고 노란색 줄무늬 등(Fig. 4)의 증상은 SVY와 다른 바이러스의 복합 감염으로 인해 나타난 병징으로 예상된다.
Fig. 3.
Virus particles observed by electron microscopy (EM) in daffo-dils infected with snowdrop virus Y (SVY). Leaves infected with SVY were negatively stained with phosphotungstic acid and analyzed by EM, revealing filamentous rod-shaped particles. Narcissus spp. samples SA39 and SA42, in which SVY was detected, were co-infected with three viruses: SVY, narcissus late season yellows virus (NLSYV), and ner-ine latent virus (NeLV), and samples SA60 and SA66 were co-infected with four viruses: SVY, NLSYV, NeLV, and narcissus mosaic virus (NMV). Scale bar represents 500 nm.
SVY 병징 및 생물 검정.
SVY가 검출된 수선화 10점은 생육불량, 황화모자이크, 잎 뒤틀림 그리고 노란색 줄무늬 등의 전형적인 바이러스 병징이 관찰되었다(Fig. 4). 본 연구에서 채집 시기가 꽃 수확 후에 이루어졌기 때문에 아쉽게도 꽃에서의 병징은 관찰할 수 없었다. 꽃에서의 SVY의 병징은 감염 구근의 계대재배를 통하여 추가로 규명하고자 한다.
SVY가 검출된 수선화 잎을 이용하여 지표식물 19종 및 SYV 가 감염되지 않은 수선화에 즙액접종을 3회 수행하였다. 그 결과 SVY에 감염된 수선화 잎 시료를 즙액접종한 모든 지표식물에서 병징이 관찰되지 않았으며(Supplementary Fig. 1), 지표식물 접종엽과 상엽의 SYV에 대한 RT-PCR 진단에서도 모두 음성으로 나타났다.
SVY 전체 염기서열 분석.
SVY 분리주 SA66의 전체 염기서열은 10,560 nt로 구성되며, 양 말단에 비번역 부위(untrans-lated region, UTR)가 존재하는 1개의 ORF를 가진다(Fig. 1B). ORF는 169-10,314 nt에 위치하였으며, UTR은 5' 말단에 168 nt 그리고 3' 말단에 246 nt (poly-A tail 제외)로 구성되었다. SVY 분리주 SA66의 전체 염기서열은 NCBI GenBank에 등록하였으며(accession no. LC757029), 기보고 분리주 4241-SVY-HTS (OP871788)와 뉴클레오타이드 상동성이 99.6%, 아미노산 상동성이 99.7%로 나타났다. SVY 분리주 SA66의 ORF는 372 kDa 의 다단백질을 암호화하고 있으며, 10개 기능단백질(mature protein)인 P1 (protein 1), HC-Pro (helper component-proteinase), P3 (protein 3), 6K1 (6 KDa peptide 1), CI (cylindrical inclusion), 6K2 (6 KDa peptide 2), NIa-VPg (nuclear inclusion a-viral protein genome-linked), NIa-Pro (nuclear inclusion a-proteinase), CP로 가수분해되어 기능할 것으로 판단된다(Fig. 1B). 기능단백질의 각 절단 부위는 다음과 같다: ITQY/SS (P1/HC-Pro); YRVG/GN (HC-Pro/P3); VYFQ/AK (P3/6K1); VRFQ/SL (6K1/CI); VQFQ/NS (CI/6K2); VQFQ/GY (6K2/NIa-VPg); VLFE/SK (NIa-VPg/NIa-Pro); VRLQ/GT (NIa-Pro/NIb); VRFQ/MS (NIb/CP). 그리고 P3 단백질에 겹쳐있는 PIPO (pretty interesting potyviridae ORF)를 확인하였다. Mature peptide인 PIPO는 포티바이러스의 식물체에 감염 이후 세포 간 이동에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Chung 등, 2008; Rodamilans 등, 2015). PIPO는 P3 내에 있는 종결코돈의 위치에 따라 길이가 다양하며(Chung 등, 2008; Olspert 등, 2015; Rodamilans 등, 2015), 분리주 SA66의 PIPO는 3,817-4,073 nt에 위치하여 85개의 아미노산으로 이루어져 있다. HC-Pro에서는 PTK motif (727-729 aa)를, 그리고 CP에서는 DAG motif (3,114-3,116 aa)를 확인할 수 있었다. 2개 motif는 진딧물에 의한 포티바이러스의 비영속전염에 관여하는 것으로 알려져 있다(Gadhave 등, 2020; Lee 등, 2010; Lucinda 등, 2012).
SVY 분리주 SA66의 기능단백질 상동성 및 유연관계 분석.
결정한 SVY 분리주 SA66는 10개 기능단백질 영역으로 나누어 기존에 알려진 SVY 분리주(accession nos. OP871788, MH886519, EU927399)와 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열의 상동성을 비교하였다(Table 3). 기존에 전체 염기서열이 알려진 분리주 4241-SVY-HTS (OP871788)와는 모든 기능단백질에 대하여 상동성을 분석하였으며, 나머지 2개 분리주(MH886519와 EU927399)는 일부 서열이 보고되어 있기에 분리주 SA66과 일부 기능단백질 영역에서 상동성을 분석하였다. 상동성 분석 결과 SA66은 분리주 4241-SVY-HTS와 P1 영역에서 뉴클레오타이드 서열 상동성이 99.4%, 아미노산 서열 상동성이 99.8%로 나타났다. 또한 SA66과 기보고 3개 분리주의 CP 영역에서 뉴클레오타이드 서열 상동성은 99.5-99.8%이며, 아미노산 서열 상동성은 99.3-99.6%로 나타났다. P1 및 CP 영역을 제외한 나머지 기능단백질 영역에서는 뉴클레오타이드 서열 상동성이 99.1-100%로 나타났다. 그리고 결정한 SVY 분리주 SA66과 Potyviridae 과에 속하는 바이러스 31종의 다단백질 전체 염기서열을 이용하여 유연관계를 분석하였다(Supplementary Table 3). 분석 결과 국내 수선화에서 검출된 SVY는 포티바이러스 속에 속하였으며, 4241-SVY-HTS 분리주와 같은 그룹을 형성하였다(Fig. 5).
Fig. 5.
Phylogenetic tree based on the nucleotide sequences of complete polyprotein of snowdrop virus Y (SVY) isolate SA66 and 31 viruses of the family Potyviridae. The SVY isolate SA66 (accession no. LC757029) in this study (blue letter), another SVY isolates previously registered to National center for biotechnology information (NCBI) data base (accession no. OP871788), and 31 viruses (17 Potyvirus, 2 Ipomovirus, 2 Macluravirus, 1 Arepavirus, 1 Brambyvirus, 2 Poacevirus, 2 Roymovirus, 2 Rymovirus, 2 Tritimovirus) belonging to family Potyviridae were used in the phylogenetic tree analysis. The analysis was performed by the maximum-likelihood method in MEGA software version 11, using the Jones-Taylor-Thornton (JTT) model with 1,000 bootstrap replicates the scale bar indicates 0.2 scale bar represents genetic distance.
Table 3.
The complete n ucleotide and amino acid sequences identity (%) between the mature proteins of snowdrop virus Y (SVY) isolate SA66 and all other SVY isolatesa
| Mature protein | SVY isolates registered in the NCBI | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| OP871788 | MH886519 | EU927399 | ||||
| nt | aa | nt | aa | nt | aa | |
| P1 | 99.4 | 99.8 | *b | *b | *b | *b |
| HC-Pro | 99.4 | 99.5 | 99.4 | 99.4 | *b | *b |
| P3 | 99.8 | 99.6 | *b | *b | *b | *b |
| 6K1 | 99.4 | 100.0 | *b | *b | *b | *b |
| CI | 99.5 | 99.8 | *b | *b | *b | *b |
| 6K2 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | *b | *b |
| NIa-VPg | 99.7 | 99.5 | 99.1 | 98.4 | *b | *b |
| NIa-Pro | 99.6 | 100.0 | 99.5 | 98.8 | *b | *b |
| NIb | 99.6 | 99.8 | 96.8 | 97.5 | *b | *b |
| CP | 99.8 | 99.6 | 99.5 | 99.3 | 99.5 | 99.6 |
NCBI, the National Center for Biotechnology Information; nt, nucleotide; aa, amino acid; P1, protein 1; HC-Pro, helper component-prote-ase; P3, protein 3; 6K1, 6 KDa peptide 1; CI, cylindrical inclusion protein; 6K2, 6 KDa peptide 2; NIa-VPg, nuclear inclusion A-viral protein genome linked; NIa-Pro, nuclear inclusion A protease; NIb, nuclear inclusion B; CP, coat protein.
고 찰
국내 재배되고 있는 수선화에서 바이러스 병징을 나타내는 시료 75점을 채집하여 메타전사체 분석 및 RT-PCR 진단으로 SVY 특이 염기서열을 검출하였다. RT-PCR 양성 반응 시료를 이용하여 SVY 분리주 SA66의 전체 염기서열을 분석하였으며, 아울러 채집된 시료의 SVY 감염 실태, 다양한 품종에서 검출된 10개 분리주의 외피단백질 유전자 염기서열 분석, 전자현미경 검경 및 생물 검정을 통하여 수선화에서 SVY를 국내 최초로 동정하였다.
SVY 분리주 SA66의 전체 염기서열은 Fig. 1과 같이 10개 기능단백질, P1, HC-Pro, P3, 6K1, CI, 6K2, NIa-VPg, NIa-Pro, NIb 그리고 CP로 구성되는 전형적인 포티바이러스 게놈 구조를 가지고 있었다. 그리고 포티바이러스의 진딧물 전염에 관여하는 PTK와 DAG motif (Gadhave 등, 2020; Knierim 등, 2017; Lee 등, 2010; Lucinda 등, 2012)를 확인하였으며, 바이러스 감염에서 세포 간 이동에 관여하는 mature peptide인 PIPO (Chung 등, 2008; Rodamilans 등, 2015)가 존재하였다. 이로 볼 때, SVY는 진딧물에 의하여 충매전염될 것으로 추정된다. 기존에 영국 수선화에서 SVY의 전체 염기서열은 보고되었지만(Forde 등, 2023), 10개 기능단백질에 대한 염기서열 분석은 본 연구에서 최초로 수행되었다. 이러한 연구 결과는 현재 unclassified Potyvirus(포티바이러스)로 분류된 SVY의 분류학적 위치 확립에 기여할 것으로 기대된다.
전체(Table 3) 및 외피단백질(Fig. 2) 염기서열 분석 결과에서 국내 분리주를 포함하여 현재까지 보고된 SVY 4개 분리주의 유전적 변이 정도로 판단할 때, SVY는 생태적으로 동일한 기원을 가지는 것으로 사료된다. 대조적으로 포티바이러스 중 한 종인 turnip mosaic virus (TuMV)는 318종 이상의 식물에서 보고되었으며, 외피단백질 유전자 서열에서 변이가 발생한 다양한 분리주가 보고되었다(Nigam 등, 2019). TuMV의 경우, 배추에서 검출된 분리주 집단과 무에서 검출된 분리주 집단은 외피단백질 유전자 영역에서 88.3-92.0%의 뉴클레오타이드 상동성을 나타내는 것(Sánchez 등, 2003)과 대비하여, 서로 다른 식물 3종(무스카리, 설강화, 수선화)에서 검출된 SVY 분리주들은 99.5-99.8%의 상동성을 나타내었다. 이러한 결과들로 볼 때, 앞으로 더 많은 SVY 분리주가 알려져야겠지만, 현재까지 밝혀진 SVY 분리주들은 유전적으로 매우 유사함을 알 수 있다. 아울러 SVY는 지금까지 비짜루목(Asparagales)에 속하는 무스카리, 설강화 그리고 수선화에서만 알려져 있으며, 본 연구에서 다양한 지표식물에서 즙액접종이 이루어지지 않은 점으로 판단할 때, SVY의 기주 범위는 넓지 않을 것으로 예상된다.
앞에서 기술한 염기서열 분석 결과와 SVY의 검출 양상(Table 2)으로 볼 때, SVY의 국내 분포 여부는 두 가지 측면으로 판단해야 할 것으로 생각된다. 첫 번째는 신안지역 농가에서 검출된 SVY는 외국으로부터 감염주가 포함된 수입구근을 사용하여 재배가 이루어졌을 가능성이 있다. 수선화 구근을 대상으로 한 우리나라 국경검역에서는 6종의 바이러스(ArMV, RpRSV, SLRSV, TRSV, TBRV, ToRSV)에 대하여 검사를 실시하고 있으나(Animal and Plant Quarantine Agency, 2022), SVY는 현재 검사 대상으로 다루지 않기 때문이다. 그러나 본 연구에서 SVY는 4개 지역(거제, 신안, 원주, 예산) 중에서 신안에서만 검출된 점과 다른 지역에서 SVY가 검출된 품종에서 검출되지 않은 점을 고려할 때, 신안지역 특정 품종으로만 유입되었다고 설명하기는 어려운 점도 있다. 두 번째는 최근에 SVY가 감염된 수선화 수입 구근을 통하여 신안지역에 발생하게 되었고, 후속적으로 농가포장 또는 주변에 SVY의 전염원이 존재하게 되어, 진딧물을 통하여 재배되고 있는 수선화 여러 품종에 SVY가 자연적으로 전염되었을 가능성이 있다. 이러한 가능성은 신안에서 채집한 모든 수선화 품종에서 SVY가 검출된 점, 각 품종에서 일부의 시료만 감염된 점(‘고블렛’에서 3/11점, ‘리플리트’에서 1/10점, ‘살로우’에서 4/9점 그리고 ‘타이티’에서 2/10점) 그리고 ‘리플리티’와 ‘타이티’는 3개 지역(신안, 원주, 예산)에서 동일하게 재배되는 수선화 품종이지만, 신안의 품종에서만 SVY가 검출된 점으로 뒷받침된다. 그러나 SVY의 현재 국내 분포 여부에 대한 판단은 수선화 수입구근에서의 SVY 감염 여부와 수선화 재배지에 대한 추가적인 발생 실태 조사를 통하여 후속적으로 판단하여야 할 것이다.
영양번식으로 재배가 이루어지는 수선화는 감염된 구근을 통하여 다음 세대로 수직적으로 바이러스의 전염이 이루어진다(Shin 등, 2002; Raj 등, 2021). 수선화에 발생하고 있는 SVY는 지금까지 발생 실태, 매개체, 중간기주, 병원성 등에 대한 연구가 매우 미진한 상태에 있으나, 본 연구에서 SVY가 검출된 수선화의 병징과 생육 상태(Fig. 4)를 고려할 때 수선화 품질 및 생산량에 상당한 영향을 미치고 있는 것으로 예상된다. 수선화 구근의 국내 수입량은 점차 증가하고 있으며, 앞서 언급한 바와 같이 구근을 통하여 SVY가 유입될 가능성이 매우 높음으로 국경검역을 통한 SVY의 국내 유입차단이 필요할 것이다. 또한 SVY 가 신안에 자연적으로 발생하고 있을 가능성도 긴급히 조사가 이루어져야 할 것으로 판단된다. 본 연구는 국내에서 SVY에 대한 첫 보고이며, 수선화의 바이러스병 관리에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
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