*Corresponding author 서 론
감(Diospyrus kaki)의 국내 재배면적은 23,918 ha이며, 연간 생산량은 263,030톤으로, 사과와 감귤 다음으로 중요한 과수 작물이다(Korea Statistical Information Service, 2018). 탄저병은 감의 생산량에 직접적으로 영향을 줄 뿐만 아니라 품질 저하에도 큰 영향을 미치기 때문에, 감 재배 농민들은 재배 기간 중 가장 문제가 되는 병으로 탄저병을 들고 있다(Lee 등, 2001; Lim 등, 2008). 세계적으로도 6번째 생산국으로 알려져 있는 브라질의 São Paulo와 Paranã주에서도 2010년부터 2020년까지 감의 생산량이 28.4%와 50.1%가 감소하기도 하였다(de Aguiar Carraro 등, 2022). 감의 생산에 큰 피해를 일으키는 탄저병의 원인균으로는 병원균의 형태학적인 특징을 기반으로 Gloeosporium kaki가 일본에서 최초로 보고되어 있다(de Aguiar Carraro 등, 2022). 그 후 유전자 분석을 통해서 Colletotrichum horii로 동정되었고, 최근에는 C. gloeosporioides의 복합종 내에서 C. horii 로 재분류되었다(Weir와 Johnston, 2010; Weir 등, 2012). 하지만 그 후에도 감나무 탄저병을 일으키는 병원균으로서 C. acutatum, C. karstii, C. siamense와 C. nymphaeae 등이 보고되었다(Hassan 등, 2018, 2019; Wang 등, 2016; Williamson와 Sutton, 2010). 브라질에서는 ITS, GAPDH, TUB2 유전자의 염기서열을 이용한 다중유전자 계통분석을 통해서 C. horii, C. fructicola, C. nymphaeae, C. melonis 등을 보고하였다(Carraro 등, 2019; de Aguiar Carraro 등, 2022). 이처럼 동일한 기주식물에서 다양한 Colletotrichum의 종이 탄저병의 원인균으로 보고되어 있고, 종에 따른 살균제의 반응이 다르다면, 탄저병을 방제하기 위한 살균제 선발이 어려워질 수 있다(Abdullahi 등, 2023). 그러다 보니 최근에는 병원균의 생물학적 특성, 분류학적 다양성 및 살균제에 대한 감수성 등을 고려하여 보다 효과적인 병 관리 전략을 수립하고 있다(Boufleur 등, 2021; da Silva 등, 2020; Dowling 등, 2020). 특히 살균제의 다년간 사용으로 인하여 발생하는 병원균의 살균제 저항성 문제는 병 관리 전략 수립에 매우 큰 영향을 미친다.
Triazole계 살균제는 식물곰팡이병의 관리에 널리 사용되는 중요한 살균제 그룹으로, 다양한 농작물에서 곰팡이의 침입 예방과 치료에 필수적인 역할을 하고 있다. Tebuconazole을 비롯하여 triazole계에 속하는 살균제는 곰팡이의 ergosterol 생합성 과정 중에서 lanosterol의 메틸기를 제거하는 탈메틸화 효소의 활성을 억제함으로써 세포막의 중요한 구성 요소인 ergosterol의 생산을 저해하고, 결국에는 세포막의 안정성을 감소시켜 병원성 곰팡이의 생장을 억제한다. 그러나 triazole계 살균제의 장기적인 사용은 저항성 진균의 출현을 초래하게 되었으며, 이는 농업 생산성을 위협하는 요소로서 작용하고 있다. 감나무탄저병균도 이미 ergosterol 저해 살균제에 대한 저항성 발현이 보고되어 있다(Yeon 등, 2019). Triazple계 살균제에 대한 저항성균은 주로 단감 재배지역으로 알려져 있는 경남 창원, 전남 영암, 나주, 순천 등지에서 분리되었으며, 곶감을 생산하기 위해서 감을 재배하는 지역인 경북 상주, 충북 영동, 경남 산청 등에서는 감수성균들이 분리되었다.
살균제에 대한 저항성균의 발생은 이미 오래 전부터 다양한 병원균에서 보고되어 있다(Deising 등, 2008). 1960년대 말부터 개발되기 시작한 특이한 작용점을 갖는 침투이행성 살균제가 포장에서 다양한 병원균의 방제에 사용되기 시작하면서, 19070년에 Venturia inaequalis와 Botrytis cinerea에서 benzimidazole계 살균제에 대한 저항성균의 발생이 보고되었으며, 1998년에는 Blumeria graminis에서 strobilurin계 살균제에 대한 저항성이 보고되었다. 저항성균이 발생하는 기작으로는 작용점 유전자의 돌연변이나 과발현과 수송 단백질의 과발현 등이 알려져 있다(Yin 등, 2023). 여러 가지 기작에 의해 발생하는 살균제 저항성은 질적인 저항성과 양적인 저항성으로 구분한다. 질적인 저항성의 대표적인 기작은 작용점 유전자의 돌연변이이며, 양적 저항성은 작용점 유전자나 막상에 존재하는 수송 유전자의 과발현이 관여한다. 그런데 ergosterol 생합성 과정 중에서 C14-탈메틸화 효소의 활성을 억제하는 살균제의 저항성 발생 기작으로는 작용점 유전자의 돌연변이와 과발현이 모두 보고되어 있다(Nikou 등, 2009; Schnabel과 Jones, 2001; Wei 등, 2020).
본 연구에서는 국내에서 분리한 tebuconazole 저항성 감나무탄저병균의 저항성 발생 기작을 구명하기 위해서, 감수성과 저항성인 감나무탄저병균을 선발하여 tebuconazole이 ergosterol 생합성에 미치는 효과를 GC/MS 분석을 통해서 조사하였다. 또한 감수성균과 저항성균의 CYP51 유전자의 염기서열과 발현 정도를 조사하여 그 결과를 보고하고자 한다. 이러한 연구의 결과는 식물 병원균의 방제뿐만 아니라, 살균제 저항성 관리를 위한 방안을 제시할 수 있으며, 식물 병원성 곰팡이의 살균제 저항성 기작을 이해함으로써 향후 새로운 살균제 개발과 지속적인 식물병 관리 전략 수립에도 중요한 기초 자료가 제공될 것으로 생각한다.
재료 및 방법
실험에 사용한 균주.
병든 감의 발병 조직에서 단포자 분리하여 충북대학교 식물의학과 식물진균병학연구실에서 보관하던 Colletotrichum horii를 사용하였다. 본 실험에는 2015년과 2016년에 경북 상주, 충북 영동, 경남 청원, 전남 나주와 순천 영암 등지에서 분리한 73개의 균주를 tebuconazole 감수성 균주 40개와 저항성 균주 33개로 나누어 실험에 사용하였다. 선발한 모든 균주는 tebuconazole의 작용점 유전자인 CYP51 유전자를 증폭하여 염기서열 분석을 실시하였으며, 감수성과 저항성인 C. horii 15GKYD4와 C. horii 15GKNJ1을 선발하여 sterol을 분석하였다. 또한 감수성 균주인 15GKYD3, 15GKYD4, 15GKYD8, 15GKOC1 등 4균주 그리고 저항성 균주인 15GKYA1, 15GKYA2, 15GKSC2, 15GKNJ1 등 4균주를 선발하여 CYP51 유전자의 발현 정도를 조사하였다.
한천희석법을 이용한 병원균의 살균제 감수성 조사.
C. horii의 C14-demethylase inhibitor (DMI) 살균제에 대한 반응을 조사하기 위하여 tebuconazole (a.i. 20%, SC)을 선발하여 실험하였다. 병원균을 25°C의 암 조건에서 7일간 배양한 후, 균사 선단에서 직경 3 mm의 균사 조각을 떼어 각 살균제가 농도별로 첨가된 potato dextrose agar (PDA) 배지(Dif-coTM; Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA)에서에 균사가 자란 면이 밑으로 가도록 뒤집어서 접종하였다. 이 때 PDA 배지의 tebuconazole의 최종 농도는 0.00005, 0.0005, 0.005, 0.05, 0.5, 5.0 μ g/ml로 조정하였다. 또한 배양 중에 세균의 오염을 방지하기 위하여 배지에서 streptomycin 을 최종 농도가 300 μg/ml가 되도록 첨가하였다. 접종한 병원균은 다시 25°C의 암 조건에서 4-6일간 배양한 후, 살균제를 첨가하지 않은 배지에서 균총의 직경이 30-40 mm가 되었을 때 균총 직경을 조사하였다. Tebuconazole의 균사 생장 억제 효과(%)는 다음 식에 의해서 계산하였다: 균사 생장 억제 효과(%) = [1 - (살균제 첨가 배지의 균총 직경 / 살균체 무첨가 배지의 균총 직경)] × 100.
병원균의 sterol 분석.
Tebuconazole 감수성인 C. horii 15GKYD4와 저항성인 C. horii 15GKNJ1을 25°C의 PDA 배지에서 배양하고, 형성된 포자를 수확하여, potato dextrose broth (PDB) 배지(Becton, Dickinson and Company)에 포자의 최종 밀도가 1×106개/ml가 되도록 접종하였다. 병원균을 접종한 PDB에 tebuconazole을 각 균주의 EC50 농도로 처리하였다. 감수성인 C. horii 15GKYD4는 0.009 μ g/ml가 되도록, 그리고 저항성인 C. horii 15GKNJ1은 0.9 μ g/ml가 되도록 각각 처리하였다. 이후, 25°C의 암 조건에서 180 rpm으로 10일간 진탕 배양한 후, 1,500 rpm에서 원심분리하여 균사체를 수확하였다. 수확한 균사체는 살균 증류수를 가지고 2회 세척하고, 동결건조하였다. 병원균의 sterol 추출을 위하여 수확한 균사체를 30 ml 유리 시험관에 담고, 1.5 ml의 0.5 M potassium phosphate monoba-sic 용액과 chloroform 7.5 ml, methanol 2.5 ml를 차례로 첨가한 후, 15초간 강하게 흔들어 주었다. 상온에서 2,500 rpm으로 15분간 원심분리한 후, glass Pasteur pipette을 이용하여 하층액을 새로운 20 ml 유리 시험관에 옮기고, N-EVAP nitro-gen dryer를 사용하여 60° C에서 건조시켰다. Ethanol 1 ml과 33% potassium hydroxide 1 ml를 차례로 첨가한 후, 15초간 다시 강하게 흔들어 주었다. 혼합액은 80°C에서 30분간 반응시키며, 10분 간격으로 강하게 흔들어 준 후, 4°C에서 충분히 냉각시켰다. 다시 ultrapure water 3 ml와 hexane 3 ml를 차례로 첨가하고, 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, hexane층을 수확하여 gas chromatography-mass spectroscopy (GC-MS)로 sterol을 분석하였다. 분석에는 agilent DB-1 column(길이, 30 m; 직경, 250 μ m; film thickness, 0.25 μ m)을 사용하였으며, carrier gas는 helium을 10 ml/min의 조건으로 사용하였다. Split mode ratio는 10:1로 사용하며, 시료는 5 μ l를 주입하였다. Oven 온도는 150°C에서 시작 후 295°C까지 분당 18°C씩, 295°C에서 306°C까지 분당 1°C씩, 306° C에서 325°C 까지 분당 18°C씩 상승하도록 설정하였고, 325°C에서 마지막으로 1분간 작동하였다. 주입구와 검출기의 온도는 300°C로 조절하여 분석하였다. Sterol의 동정은 GC-MS로부터 시료의 total ion chromatogram을 얻은 후, WILEY 138 library (Agilent Techonogies, Santa Clara, CA, USA)의 표준폼 mass spectrum (The Wiley Registry of Mass Spectral Data, 7th eds.)과 비교하여 실시하였다.
CYP51 유전자의 증폭 및 염기서열 분석.
병원균에서 추출한 gDNA를 주형 DNA로 사용하였으며, CG-cyp14aF (TCA TTA CCA CCA ACC GTC TT)와 CG-cyp14R (TCA CGA GAC CAT ACC CAT AG) primer를 제작하여 CYP51 유전자를 증폭하였다. 유전자를 증폭하기 위한 PCR 반응액은 gDNA 0.1 μ g, 10 X KAPA Taq buffer with dye 2.5 μ l, 2.0 mM의 dNTP 2.5 μ l, Taq DNA polymerase (5 U/μ l, Kapabiosystems) 0.1 μ l, 멸균증류수 15.9 μ l, 10 pmol의 primer를 각각 1 μ l를 첨가하여 준비하였다. PCR 반응은 95°C에서 4분간 pre-denaturation을 수행 후, 95°C에서 30초간 denaturation, 53°C에서 1분간 annealing, 72°C에서 1분 30초간 extension 과정을 35회 반복하였고, 72°C에서 7분간 final extension 과정을 수행 후 종료하였다. 증폭된 PCR 산물을 확인하기 위해 1× TAE buffer로 1% agarose gel을 만들고 safe viewTM classic을 권장 사용량에 따라 첨가한 후, 100 V 에서 40분간 전기영동하고, UV-transilluminator로 확인하였다. 증폭된 PCR 산물은 ExpinTM PCR SV Kit (GeneAll, Seoul, Korea)를 사용하여 정제한 후 Macrogen (Daejeon, Korea)에 염기서열 분석을 의뢰하였다. 분석된 CYP51 유전자의 염기서열은 PHYDIT ver. 3.1을 이용하여 정리하였고, MEGA ver 7.0에서 정렬한 후 비교 분석하였다.
감나무탄저병균의 cDNA 합성.
수확한 C. horii의 포자를 PDB 배지에 1×106개/ml의 밀도로 현탁한 후, 2.0 ml tube에 1 ml씩 분주하고 25°C의 암 조건에서 24시간 정치배양하였다. 배양액을 제거하고 남은 균체에 tebuconazole을 처리하고, 상온에서 정해진 시간 동안 180 rpm으로 진탕 배양하였다. 균사체는 원심분리하여 수확하였고, RNA 추출을 위하여 액체질소를 처리하였다. RNA는 TRIzolTM 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 추출하였다. TRIzolTM 시약 1 ml를 액체질소를 처리한 시료에 첨가하고 상온에서 5분간 보관한 후, chloroform 200 μ l를 첨가하여 가볍게 흔들어 주었다. 시료를 상온에 2-3분간 보관한 후, 4°C에서 12,000 rpm으로 15분간 원심분리 하였다. 상층액을 취하여 새로운 1.5 ml tube에 옮기고 isopropyl alcohol 500 μ l를 첨가하였다. 상온에서 10분간 반응시킨 후, 4°C에서 12,000 rpm으로 10분간 원심분리하였다. 상층액을 버리고 침전물만이 남은 1.5 ml tube에 75% ethanol 1 ml를 첨가하여 간단히 흔들어 주고, 4°C에서 7,500 g으로 5분간 원심분리하였다. 상층액을 버린 후 상온에서 5-10분 동안 건조시켰다. 건조가 된 침전물에 TE buffer 20-50 μ l를 첨가한 후 60°C의 항온수조에 15분간 처리하였다. 추출한 RNA는 −20°C에 보관하여 사용하였으며 RNA의 정량은 nano drop (Micro-p, M600)을 이용하여 순도와 RNA의 농도를 확인하였다. 추출한 RNA는 ReverTra Ace® qPCR RT master mix (TOYOBO, Osaka, Japan)를 사용하여 cDNA로 합성하였다. 반응액은 5× RT Master Mix 2 μ l, nuclease-free water 4 μ l, RNA 4 μ l를 첨가하여 만들었다. 반응은 37°C에서 15분, 50°C에서 5분, 98°C에서 5분 수행 후 종료하였다.
CYP51 유전자의 발현 정도 조사.
유전자 발현 정도를 조사하기 위해서 감수성 4균주(C. horii 15GKYD3, 15GKYD4, 15GKYD8, 15GKOC1)와 저항성 4균주(C. horii 15GKYA1, 15GKYA2, 15GKSC2, 15GKNJ1)를 사용하였으며, 감수성 균주와 저항성 균주의 유전자 발현 정도는 4균주의 평균을 구하여 비교하였다. CYP51 유전자의 발현 정도 확인을 위해 Q-C. h14a-F (5'-GTC GCA AGA ACG GTG ATA CT-3’)와 Q-C.h14a-R (5'-ATA TGC GCG ATC TCC TTG TC-3’) primer와 β-tubulin 유전자 증폭을 위하여 b-tub_F2 (5'-GTT CCC TCT CCC AAG GTT TC-3’)와 b-tub_R2 (5'-GTC AAT GCA GAA GGT CTC GT-3') primer를 사용하였다. Real time PCR을 수행하기 위하여 Applied Biosystems StepOnePlusTM Real-time PCR system (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하였다. 반응액은 PowerSYBR® Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific) 5 μ l, forward와 reverse primer를 각각 1 μ l, cDNA 3 μ l를 첨가하여 준비하였으며, 반응 조건은 Table 1과 같았다.
결과 및 고찰
Tebuconazole에 대한 반응.
감나무탄저병균은 tebuconazole의 처리한 농도에 따라서 감수성과 저항성으로 구분되었다. Fig. 1에서 보는 것과 같이 15GKYD3, 15GKYD4, 15GKYD8, 15GKOC1의 EC50값은 0.010-0.011 μ g/ml였으며, 15GKYA1, 15GKYA2, 15GKSC2, 15GKNJ1의 EC50값은 0.489-2.858 μ g/ml 였다(Fig. 1). 국내에서 tebuconazole에 대한 감나무탄저병균의 저항성은 지역에 따라서 차이가 있었다. 감은 지역에 따라서 재배하는 종류가 다르기 때문에 재배와 병해충 관리 방법도 많이 다르다. 그러다 보니 떫은 감을 재배하는 중부 지역에서는 약제 살포가 연평균 3-5회 정도 이루어지지만(Lim 등, 2008; Yu 등, 2017), 단감 과원에서는 연 8-9회 정도가 이루어진다(Lee 등, 2001). 이처럼 지역에 따라 약제 처리 횟수가 다르기 때문에 저항성 발생도 차이가 있을 것으로 생각한다(Hirooka와 Ishii, 2013).
Fig. 1.
Effect of tebuconazole on the mycelial growth of Colletotrichum horii causing persimmon anthracnose. The effect of tebuconazole on C. horii causing persimmon anthracnose was presented by the inhibition ratio (%) of mycelial growth investigated through the agar dilution method on potato dextrose agar medium. In this figure, 15GKYD3, 15GKYD4, 15GKYD8, and 15GKOC1 were included into the susceptible group, while 15GKYA1, 15GKYA2, 15GKSC2, and 15GKNJ1 were done into the resistant group.
Tebuconazole의 처리에 따른 sterol 성분의 변화.
Tebuconazole에 대해서 감수성인 15GKYD4와 저항성인 15GKNJ1에 tebuconazole을 처리한 결과, 두 균주 모두에서 ergosterol 과 lanosterol 등의 sterol 조성이 변화하였다(Fig. 2, 3). Table 2에서 보는 것처럼 15GKYD4의 경우, tebuconazole을 처리하지 않았을 때 ergosterol의 비율이 81.07%였으나, 살균제를 처리하면 71.38%로 감소하였고, lanosterol의 비율은 9.73%로 증가하였다. 15GKNJ1의 경우에도 동일하게 살균제를 처리하지 않았을 때 100%였던 ergosterol의 비율이 0.9 μ g/ml 의 tebuconazole을 처리했을 때, 71.59%까지 감소하였고 lanosterol은 4.86%로 증가하였다. 15GKNJ1에 10.0 μ g/ml 의 tebuconazole을 처리하면 ergosterol 함량은 더욱 감소하여 33.81%가 되었으며, lanosterol은 44.39%까지 증가하였다. 이미 tebuconazole과 같은 triazole계 살균제의 작용기작은 C14-탈메틸화 효소의 활성을 저해함으로써 lanosterol 과 다른 sterol의 합성이 증가하게되고, 곰팡이의 세포막 구성 성분인 ergosterol의 합성이 감소하는 것으로 알려져 있다(Kato, 1986; Sisler와 Ragsdale, 1984). Table 2에서도 tebuconazole 처리에 의해서 감수성과 저항성 균주인 15GKYD4와 15GKNJ1의 ergosterol 함량이 감소하고 lanosterol의 함량이 증가하는 것을 보면, tebuconazole에 대한 병원균의 저항성 정도는 처리하는 약량에 따라서 달라짐을 알 수 있었다. 이런 결과는 tebuconazole에 대한 감나무탄저병균의 저항성은 작용점 유전자의 돌연변이에 의한 결과가 아니라는 사실을 시사한다.
Fig. 2.
Chromatogram of sterols of sensitive isolate, as Colletotrichum horii 15GKYD4, with and without tebuconazole. Sterols were analyzed by gas chromatography-mass spectroscopy. (A) Chromatogram of the sterols 15GKYD4 not treated with tebuconazole, peaks; 1. squalene, 2. ergosterol, 3 and 4. unknown, 5. lanosterol, and 6. fucosterol. (B) That of 15GKYD4 treated with 0.009 μg/ml of tebuconazole, peaks; 1. squalene, 2. ergosterol, 3. 22-dihydroergosterol, 4. 22E,24S-24 methyl-6B-methoxy-3A, 5-cyclo-5A-cholest-22-ene, 5. unknown, 6. lanosterol, and 7. fucosterol.
Fig. 3.
Chromatogram of sterols of sensitive isolate, as Colletotrichum horii 15GKNJ1, with and without tebuconazole. Sterols were analyzed by gas chromatography-mass spectroscopy. (A) Chromatogram of the sterols of 15GKNJ1 not treated with tebuconazole, peaks; 1. ergosterol. (B) That of 15GKNJ1 treated with 0.9 μg/ml of tebuconazole, peaks; 1. ergosterol, 2. unknown, 3. laurobtusol, and 4. lanosterol.
Table 2.
Effect of tebuconazole on the ergosterol biosynthesis of Colletotrichum horii
| Isolate | Concentration (μ g/ml) | Percentage (%) of sterols | |||
|---|---|---|---|---|---|
| Ergosterol | Lanosterol | Squalene | Other | ||
| 15GKYD4 | 00 | 081.07 | 00.00 | 4.16 | 14.84 |
| 00.009a | 071.38 | 09.73 | 1.39 | 17.50 | |
| 15GKNJ1 | 00 | 100.00 | 00.00 | 0.00 | 00.00 |
| 00.9b | 071.59 | 04.86 | 0.00 | 23.55 | |
| 10.0c | 033.81 | 44.39 | 0.00 | 21.80 | |
C. horii의 CYP51 유전자 상에서 점돌연변이 확인.
C. horii 의 tebuconazole에 대한 저항성 기작을 규명하기 위해서 감수성 40균주와 저항성 33균주의 CYP51 유전자를 증폭하여, 점돌연변이를 확인하였다. 실험에 사용한 모든 균주에서 Fig. 4에서 보는 것과 같은 1,248 bp의 증폭산물을 얻을 수 있었으며, 증폭한 CYP51 유전자의 염기서열을 분석한 결과, 감수성 균주와 저항성 균주 모두에서 점돌연변이가 확인된 부위는 없었고, 유전자의 염기서열은 모두 동일하였다(Fig. 5). 이 결과는 sterol을 분석한 결과와 함께 감나무탄저병균의 tebuconazole 저항성은 작용점 유전자에서 발생하는 점돌연변이에 의해서 일어나지 않고, 다른 저항성 기작에 의해서 발생한다는 것을 보여주고 있다.
Fig. 4.
Amplification of CYP51 gene of Colletotrichum horii by using primer CG-cyp14aF/CG-cyp14aR. The size of the amplified product is 1,248 bp. Isolates of C. horii used in this study were as follows. From 1 to 4 were sensitive to tebuconazole, such as 15GKYD3 (1), 15GKYD4 (2), 15GKYD8 (3), and 15GKOC1 (4). Resistant isolates were from 5 to 8. which were 15GKYA1 (5), 15GKYA2 (6), 15GKSC2 (7), and 15GKNJ1 (8). M, 100 bp marker; N, negative control.
Fig. 5.
Sequences of CYP51 gene of Colletotrichum horii 15GKYD4 sensitive to tebuconazole and C. horii 15GKNJ1 resistant to the fungicide. There was no difference in the nucleotide sequence. For analyzing DNA sequence of CYP51 gene in this study, 40 isolates sensitive to tebuconazole and 33 isolates resistant to the fungicide were used. There were no point mutations at all in the CYP51 gene of any strain used in the experiment, such as 15GKYD4 and 15GKNI1.
감수성 균주와 저항성 균주의 CYP51 유전자 발현 정도.
Fig. 6에서 보는 것과 같이 tebuconazole 무처리구에서 감수성인 4균주(15GKYD3, 15GKYD4, 15GKYD8, 15GKOC1)의 CYP51 유전자 발현 정도는 1.1-5.5배였으며, 0.5 μ g/ml의 tebuconazole 처리구에서도 1.7-3.9배로, 무처리구에 비하여 증가하지 않았다. 하지만 저항성인 4균주(15GKYA1, 15GKYA2, 15GKSC2, 15GKNJ1)는 tebuconazole 무처리구에서 4.0-5.3배였던 발현 정도가 처리구에서는 16.0-25.9배까지 상승하였다.
Fig. 6.
The effect of tebuconazole on CYP51 gene expression of Colletotrichum horii. The gene expression was investigated 2 hr after treating with 0.5 μg/ml of tebuconazole. Isolates of C. horii used in this study were as follows. Sensitive isolates; 15GKYD3, 15GKYD4, 15GKYD8, and 15GKOC1. Resistant isolates; 15GKYA1, 15GKYA2, 15GKSC2, and 15GKNJ1.
살균제 처리 농도가 CYP51 유전자의 발현 정도에 미치는 효과.
살균제 처리 농도가 CYP51 유전자의 발현에 미치는 효과는 감수성 4균주와 저항성 4균주의 C. horii를 사용하였으며, 각각의 평균을 구하여 비교하였다. 살균제를 처리하지 않았을 때의 CYP51 유전자 발현 정도는 저항성 균주가 감수성 균주에 비해 4배 이상 높게 나타났다. Tebuconazole을 농도별로 처리하였을 때, 감수성 균주보다 저항성 균주에서 CYP51 유전자의 발현이 상승하였다. 특히 0.05 μ g/ml의 처리구에서 저항성 균주의 CYP51 유전자 발현 정도가 감수성 균주보다 15배 이상 높게 발현되었다(Fig. 7).
Fig. 7.
CYP51 gene expression level of isolates of Colletotrichum horii sensitive or resistant to tebuconazole according to the con-centration of the fungicide. In this study, CYP51 gene expression was analyzed using four isolates, each of which was as follows. Sensitive isolates were 15GKYD3, 15GKYD4, 15GKYD8, and 15GKOC1, while resistant isolates were 15GKYA1, 15GKYA2, 15GKSC2, and 15GKNJ1. Gene expression was presented by the mean value of each 4 isolates.
이미 작용점 유전자의 과발현에 의해서 DMI 살균제에 대해서 저항성이 발현됨이 보고되어 있다(Nikou 등, 2009; Schnabel과 Jones, 2001). Nikou 등(2009)은 epoxiconazole에 대한 Cercospora beticola의 반응을 감수성, 중도저항성, 저항성 등으로 구분하였다. 중도저항성 균주인 C. beticola 45am의 CYP51 유전자에서 330번과 384번째 아미노산이 isoleucine이 threonine으로, proline이 serine으로 치환되어 있었고, 저항성 균주인 126ve에서는 297번째의 아미노산이 glutamic acid에서 lysine으로 치환되어 있었다. 하지만 또 다른 저항성 균주인 156ve의 CYP51 유전자에서 돌연변이에 의한 치환된 아미노산이 없었다. 높은 저항성 반응을 보이면서 CYP51 유전자의 297번째 아미노산이 치환된 126ve와 아미노산의 치환이 없었던 156ve 의 CYP51 유전자 발현 정도를 감수성 균주인 222s와 비교한 결과, 각각 27배에서 234배까지 증가하였다. Wei 등(2020)은 고추에서 분리한 C. gloeosporioides의 tebuconazole에 대한 반응을 EC50값 0.5 μ g/ml와 MIC값 10.0 μ g/ml를 가지고서 감수성과 저항성으로 구분하였다. 감수성이었던 YC11과 YC78의 CYP51 유전자와 다른 저항성 균주의 CYP51 유전자 염기서열을 비교한 결과, 6개의 저항성 균주 모두에서 2곳에서 5곳까지에서 돌연변이가 발생하여 아미노산이 치환되어 있었다. 하지만 아미노산의 치환 위치가 일정하지는 않았다. 또 tebuconazole 을 처리하면 감수성 균주에 비하여 CYP51 유전자의 발현 정도가 증가하였지만, 그 발현 정도가 PDA 배지에서 실시한 한천희석법의 EC50값과 비례하여 증가하지는 않았다. EC50값이 1.42 μ g/ml였던 C. gloeosporioides YC61 균주가 0.77 μ g/ml였던 YC56과 비교하여 유전자의 발현 정도는 낮았다. 이런 결과는 본 연구에서 2.85 μ g/ml였던 C. horii 15GKSC2보다 0.63 μ g/ml 였던 15GKYA1에서 CYP51 유전자의 발현 정도의 증가가 높았던 결과와 부합하는 결과였다. 이런 결과는 한천희석법으로 조사한 DMI 살균제의 저항성 정도와 CYP51 유전자의 발현 정도 증가 간의 상관관계는 낮은 것을 보여주고 있다.
살균제 처리 시간에 따른 발현 정도.
살균제 처리 시간이 CYP51 유전자의 발현에 미치는 효과 역시 감수성 4균주와 저항성 4균주의 C. horii를 사용하였으며, 각각의 평균을 구하여 비교하였다. Tebuconazole의 처리 시간에 따른 CYP51 유전자의 발현 정도 변화를 조사한 결과, 감수성 균주는 살균제를 처리하고 시간에 따라 발현되는 CYP51 유전자의 양에 거의 차이가 없었다(Fig. 8). 저항성 균주는 살균제를 처리한 직후인 30분 후에는 CYP51 유전자의 발현 정도 증가가 3.7배 정도였으나, 2시간 30분이 지나면서 30배 이상까지 크게 증가하였다. 하지만 시간이 경과함에 따라서 증가하였던 유전자 발현 정도는 점점 감소하였다(Fig. 8). 결과에서 보는 것처럼 감수성과 저항성인 C. horii 균주 간에는 tebuconazole을 2시간 30분간 처리하였을 때 CYP51 유전자의 발현에 가장 큰 차이가 나타났다. 이처럼 tebuconazole을 처리하고 단시간 안에 저항성 균주에서 작용점 유전자인 CYP51 유전자가 급격하게 증가하여 tebuconazole에 대한 저항성 반응이 나타났지만, 시간이 지나면서 발현 정도 증가가 감소하기 때문에 tebuconazole에 대한 저항성 반응도 감소하는 것으로 생각하였다. 이런 결과는 C. horii가 tebuconazole에 대해서 질적 저항성과 같은 높은 저항성 반응을 나타내지 않고, 살균제를 지속적으로 처리하면서 서서히 저항성 반응이 증가하는 양적 저항성을 나타내는 이유를 보여주고 있다고 생각한다.
Fig. 8.
CYP51 gene expression level of isolates of Colletotrichum horii sensitive or resistant to tebuconazole according to the treatment period of the fungicide. Tebuconazole was applied to the suspension at 0.5 μg/ml at the same time as the spores of C. horii were inoculated onto the potato dextrose broth medium. In this study, CYP51 gene expression was analyzed using four isolates, each of which was as follows. Sensitive isolates were 15GKYD3, 15GKYD4, 15GKYD8, and 15GKOC1, while resistant isolates were 15GKYA1, 15GKYA2, 15GKSC2, and 15GKNJ1. Gene expression was presented by the mean value of each 4 isolates.
포장에서 분리한 저항성인 감나무탄저병균의 PDA 배지에서 실험한 결과를 보더라도 배지에 처리하는 살균제의 농도가 높아지면 병원균의 생장이 억제되었다. 이 결과는 포장에서도 저항성균이 채집된 지역에서는 처리하는 tebuconazole 의 농도를 높일 경우, 저항성균에 대한 방제가 가능할 것으로 생각한다. 그런데 양적 저항성을 갖는 식물병원균이 처리하는 살균제에 점점 적응할 경우, 방제를 위해서 처리해야 하는 살균제 농도를 계속 증가해야 하기 때문에, 더 심각한 문제에 노출될 가능성도 있다. 다행스럽게도 tebuconazole에 대한 저항성균은 감수성균보다 균사 생장이나 포자 형성과 같은 포장 적응력이 떨어진다(Yeon과 Kim, 2019). 또한 PDA 배지에서의 경합 실험의 결과에서도 배지에 tebuconazole을 처리하지 않은 상태에서 세대를 진전시키면, 저항성균의 밀도가 감소하여 3세대에는 거의 소멸되었다. 하지만 0.05 μ g/ml를 처리한 경우에는 1세대에서 감수성균의 생장이 완전히 억제되기 때문에 모두 저항성균만이 검출되는 결과를 얻었다. 이런 결과를 근거로 tebuconazole과 같은 DMI 살균제의 양적 저항성에 대한 지역 간 모니터링은 계속 진행되어야 하며, 기존보다 저항성이 상승하는 지역에서는 DMI 살균제의 사용을 제한적으로 하거나, 작용기작이 다른 살균제로 대체할 수 있는 처리 체계의 확립이 필요하다.
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