실험에 사용한 병원균 및 배지

농촌진흥청 씨앗은행에서 분양받은 A. dauci KACC42997을 사용하여, 병원균의 포자 형 성과 병원성 실험을 실시하였다. 분양받은 병원균은 PDA 배지에 접종하여 25°C에서 10일간 배양하였다. 병원균의 균총 선단에서 3 mm의 균사 조각을 떼어내어 PDA 사면 배지에 접종하고 동일한 조건에서 10일간 배양한 후, 4°C에 보관하며 실험에 사용하였다. 냉장 보관과 더불어 Cryovial (직경: 12 mm, 높이: 48 mm, Simport Scientific Inc., Beloeil, Canada)를 이용하여 만든 PDA 사면 배지에 병원균을 배양한 후, 2회 멸균한 유동 파라핀을 균총 위에 붓고 실온에서 보관하였다. 당근 재배 지역에서 분리한 병원균을 사용하기 위하여, 평창, 구미, 제주의 당근 재배지에서 병든 당근 잎을 채집하고 단포자를 분리하였다. 단포자 분리한 A. dauci의 균주를 각 지역 당 69개, 57개, 44개씩 총 170개 균주를 분리하여 균사 생장과 포자 형성 정도를 조사하였다. 또한 각 지역에서 분리한 균주 중에서 포자 형성량이 많았던 평창에서 11균주, 구미 6균주, 제주 8균주 등 총 25균주를 선발하여 당근에 대한 병원성을 검정하였다.

병원균의 포자 형성에 영향을 미치는 요인

배지의 종류, 통기 처리, 그리고 자외선 처리가 A. dauci KACC42997의 포자 형성에 미치는 영향을 조사하였다. 포자 형성 배지로서 물한천 배지(agar, 15 g; 증류수, 1 liter), 20% V8 juice agar 배지(Campbell' V8 juice, 163 ml; CaCO₃, 4 g; agar, 20 g; 증류수, 1 liter)와 PDA 배지(Becton, Dickinson and Company, Difco, Sparks, MD, USA)를 사용하여 A. dauci KACC42997의 포자 형성 정도를 조사하였다. 병원균을 배지에 접종한 후, 배지가 마르는 것을 방지하기 위하여 비닐랩으로 밀봉하여 25°C의 암 상태에서 7일간 배양하였다. 병원균의 공중 균사를 제거하고 20°C로 옮긴 후, 통기 처리를 위해서 페트리 접시를 밀봉하였던 비닐랩을 제거하였으며, 자외선 처리를 위해서 12시간 간격으로 UV를 5일간 조사하였다. 통기와 자외선 처리는 단독으로 각각 처리하거나 또는 동시에 처리하였다. 배지에서 형성된 포자의 수를 조사하기 위하여, 페트리 접시(직경: 9.0 cm) 당 균사 조각(직경: 5 mm)을 총 6조각씩 떼어내어 5 ml의 멸균수에 넣고 voltex mixer (Vortex-Genie 2, Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY, USA)로 3분간 교반하였다. 포자 현탁액에서 포자의 수를 혈구계산기를 사용하여 현미경으로 관찰하였다. 균사 조각은 균총의 중앙에서 양방향으로 각각 3조각씩을 떼어내어 사용하였다.

당근의 재배

원예용 사각 50구 연결폿트(Bumnong Co., Ltd., Jeongeup, Korea)에 원예용 상토(Baroker, SeoulBio Co., Ltd., Eumseong, Korea)를 넣고, 당근 종자 3립씩 파종하여 온실에서 재배하였다. 당근은 ‘D230’, ‘K-dream’, ‘Chamjoeun’, ‘Sailo’ 등 4개 품종을 7−8엽기까지 온실에서 재배하였다.

병원균의 병원성 검정

A. dauci KACC42997을 위에서 설명한 방법으로 배양하여 포자를 형성시켰다. 병원균의 포자는 300 μg/ml의 Tween 20용액으로 수확하고, 현탁액의 포자 밀도를 1.4×10⁵, 7.0×10⁴, 3.5×10⁴, 1.7×10⁴ 개/ml로 조절하여 당근의 지상부에 분무 접종하였다. 접종한 당근은 25°C에서 1일간 습실 처리하고 온실로 옮겨 2주간 재배하며 발병을 유도한 후, 발병도를 조사하였다. 발병도는 Fig. 1과 같은 발병지수(disease index)를 사용하여 조사하였다. 발병지수 0은 유묘가 건전한 경우, 1은 잎에 병반이 관찰되기 시작하면서, 병반 면적이 전체 잎의 5% 이하일 경우, 3은 뚜렷한 병반이 엽병에서도 관찰되기 시작하며, 병반 면적이 전체 잎의 5−20%일 경우, 5는 병반 면적이 20−40%인 경우, 7은 병반 면적이 40−60%이며, 일부 잎이 시들기 시작한 경우, 9는 거의 전체 잎이 고사한 경우로 결정하였다. 발병률은 조사한 발병지수를 가지고 아래 식에서 계산하였다.

Fig. 1.

Disease index of Alternaria leaf blight. 0, no visible diseased lesion; 1, the case that lesions began to be observed on the leaves and the lesion area was less than 5% of the total leaf; 3, the case that typical lesions were also observed on the petiole, and the lesion area was 5% to 20% of the total leaf; 5, the case that the lesion area was 20% to 40% of the total leaf; 7, the case that the lesion area was 40% to 60% of the total leaf; 9, the case that almost all the leaves withered.

지역별 균주의 균사 생장과 포자 형성량 조사

평창, 구미, 제주 지역에서 분리한 A. dauci 균주 69개, 57개, 44개의 균사 생장과 포자 형성량을 조사하였다. PDA 배지에 접종하여 25°C의 암조건에서 5일간 배양한 A. dauci의 균총 선단에서 직경 3 mm 의 균사 조각을 떼어내어 새로운 PDA 배지에 접종하고, 다시 5일간 배양한 후 균총의 직경을 측정하였다. 모든 균주는 25°C 의 PDA 배지에서 7일간 배양한 후 공중 균사를 제거하고, 20°C 에서 5일간 통기 처리와 12시간 주기의 자외선 처리를 실시하여 포자 형성을 유도하였다. 포자 형성량 조사를 위하여 페트리 접시 당 6개의 균사 조각(직경: 5 mm)을 떼어내어 5 ml의 멸균수에 넣고 강하게 교반한 후, 혈구측정기를 사용하여 현미경 하에서 포자의 수를 조사하였다.

지역별 균주의 병원성 조사

실험에 사용한 170개 균주 중에서 선발한 25개 균주를 PDA 배지에서 배양하여 포자를 형성시킨 후, 300 μg/ml의 Tween 20 용액으로 수확하였다. 수확한 포자 현탁액은 4겹의 거즈에 여과하여 균사 등 잔재물을 제거하고, 포자 밀도를 1.4×10⁵ 개/ml로 조정한 후 접종원으로 사용하였다. 온실에서 4−5엽기까지 재배한 당근(품종: Chamjoeun)에 병원균을 접종하여 1일간 습실 처리한 후, 온실에서 2주간 재배하고 발병지수를 이용하여 발병 정도를 조사하였다.

통계 처리

통계분석은 SPSS 프로그램(version 24.0, IBM Corp., Armonk, NY, USA)을 이용하였으며, 처리 평균간 비교를 위하여 Duncan' multiple range test (P=0.05)를 실시하였다.

병원균의 포자 형성

통기 처리와 자외선 처리 없이 병원균을 배양하였을 때에는 모든 배지에서는 포자가 형성되지 않았다. 자외선 처리만 하였을 때에는 V8 juice agar 배지와 PDA 배지에서 포자가 각각 6×10⁴ 개/ml와 9×10⁴ 개/ml가 형성되었고, 통기 처리만을 하였을 때에는 2×10⁴ 개/ml와 1×10⁴ 개/ml가 형성되었다. 하지만 자외선과 통기 처리를 동시에 하였을 때에는, V8 배지에서 2.9×10⁵ 개/ml, PDA 배지에서는 9.8×10⁵ 개/ml로, 형성된 포자의 수가 상승하였다(Table 1, Fig. 2).

Table 1.

Effects of aeration, UV irradiation and media on sporulation of Alternaria dauci KACC42997

Fig. 2.

Spore production of Alternaria dauci KACC42997 in each medium used in the experiment. (A) Water agar medium. (B) V8 juice agar medium. (C) Potato dextrose agar medium. The A. dauci KACC42997 inoculated into each medium were cultured at 25°C for 7 days, and then cultured at 20°C for 5 days while aeration and UV treatment were performed simultaneously. Scale bars=200 μm.

Shahin과 Shepard (1979)와 Rodrigues 등(2010)은 Alternaria spp.의 포자 형성을 위해서 병원균을 먼저 균사 생장 배지에서 배양한 후, 포자 형성 배지로 옮겨서 포자 형성을 유도하였다. 균사 생장 배지에서 포자 형성 배지로 병원균을 옮겨주는 과정에서 균사에 상처를 유발하였으며, 포자 형성 배지는 18°C 의 암 상태 또는 20°C의 근자외선 조사 조건에서 배양하였다. Schouten 등(2002)은 PDA 배지에 접종한 병원균을 상온에서 7일간 배양한 후, 20°C로 옮겨서 UV를 14일간 처리한 후 포자를 수확하였다. 본 실험에서는 Schouten 등(2002)의 방법을 개선하여 A. dauci KACC42997의 포자 형성 조건을 실험하였다. 병원균을 25°C의 PDA 또는 V8 juice agar 배지에서 7일간 배양한 후, 공중 균사를 제거하고 20°C로 옮겨, 통기 및 12시간 주기로 UV를 처리하였다. A. dauci KACC42997은 통기 처리와 UV 처리를 각각 시행하였을 때보다 동시 처리하였을 때에 포자 형성량이 현저하게 증가하였다. 본 실험에서 통기 처리란 25°C의 암 상태에서 배양할 때 밀봉한 비닐랩을 제거하는 것을 의미한다. 비닐랩을 제거하게 되면, 배지에서 건조 또는 탈수 현상들이 나타나게 되어 식물병원성 곰팡이의 포자 형성이 유도되기도 한다. A. solani의 균사가 건조해질 때 포자 형성이 유도되었고, Neurospora crassa의 경우에도 균총이 건조해지면서, 포자 형성에 관여하는 유전자가 발현되기 시작하였다(Li 등, 1997; Rodrigues 등, 2010). 또한 공기의 흐름에 의해서 탈수 현상이 발생하게 되면 Petri 접시 내부의 CO₂의 양이 감소되고 O₂ 양이 증가하면서 A. solani의 포자 형성이 유도하기도 하였다(Lukens 와 Horsfall, 1973). 본 실험에서 비닐랩을 제거한 후 A. dauci KACC42997의 포자 형성이 소폭이기는 하나 상승한 이유도 통기 처리에 의한 배지의 건조 또는 탈수의 효과라고 생각한다. 배지의 밀봉 제거가 포자 형성에 미치는 영향은 Pyrenophora semeniperda에서도 찾아볼 수 있었는데, Petri 접시의 밀봉을 제거하지 않았을 때에는 P. semeniperda의 포자 형성이 억제되기도 하였다(Campbell 등, 2003). 배지의 건조 또는 탈수뿐만 아니라 광 또한 배지에서 식물병원성 곰팡이의 포자 형성에 영향을 미친다. A. alternata는 광을 쪼여 줄 경우 포자 형성이 억제되고, 암 상태에서 1일간 배양함으로써 포자 형성을 유도하기도 하였다(Pruß 등, 2014). A. solani의 경우 12시간 주기로 광을 조사할 경우 포자의 형성이 유도되었는데, 광 조사 시에 분생포자경이 형성되었고, 암 상태에서 포자가 형성되었다(Rodrigues 등, 2010). 본 실험에서 A. dauci는 균사에 상처를 유발하고 12시간 주기로 UV를 쪼여줌으로써 포자의 형성이 유도되었다.

A. dauci KACC42997의 포자 형성이 통기 또는 UV의 단독 처리에 의해서 유도되기는 하였으나, 형성되는 포자의 양이 매우 적었고, 두 처리를 동시에 실시하였을 경우 포자 형성량이 매우 큰 폭으로 상승하였으며, 이런 결과는 V8 juice agar 배지보다는 PDA 배지에서 크게 나타났다. 이것은 포자 형성에 관여하는 여러 가지 요인을 동시에 처리함으로써 배지에서 형성되는 포자의 양을 상승시킬 수 있음을 보여주는 결과라고 생각하였다.

PDA 배지에서 형성된 A. dauci KACC42997의 병원성

당근 품종 ‘D230’에서 발병률은 15.6%, ‘K-dream’과 ‘Sailo’에서는 33.3%와 46.7%이었으며, ‘Chamjoeun’은 71.4%이었다(Fig. 3). Fig. 4에서 보는 것과 같이, A. dauci KACC42997의 포자 밀도가 1.7×10⁴ 개/ml에서 14.0×10⁴ 개/ml로 상승하면서, 7−8엽기의 ‘Chamjoeun’ 당근에서 발병률도 15.1%에서 60.0%로 증가하였 다. A. dauci KACC42997의 병원성은 당근의 품종과 접종하는 포자의 밀도에 따라서 달라지기는 하였지만, PDA 배지에서 형성된 포자가 당근에 검은잎마름병을 일으킬 수 있음을 확인할 수 있었다.

Fig. 3.

Pathogenicity of Alternaria dauci KACC42997 according to carrot cultivars and leaf stages. The spores of A. dauci KACC42997 formed in the potato dextrose aga medium were inoculated into 7−8 leaf stage carrots. Four kinds of carrot cultivars were used in the experiment. The spore density of the inoculum suspension was adjusted to 1.4×10⁵ conidia/ml, and after spray inoculation of the suspension, it was kept in a humidity chamber at 25°C for 1 day and then transferred to a greenhouse. Two weeks after inoculation with the pathogen, the degree of disease was investigated using the disease index in Fig. 1.

Fig. 4.

Pathogenicity of Alternaria dauci KACC42997 according to spore density of spore suspension and carrot leaf stage. To pro-duce spores, A. dauci KACC42997 was inoculated into potato dextrose agar (PDA) and cultured at 25°C for 7 days. The pathogens were transferred to 20°C and cultured for 5 days while aeration and UV irradiation with 12-hr cycles were performed. Spores formed on the PDA were harvested using 300 μg/ml of Tween 20 solution. The spore density of the suspension was adjusted to a defined density. The prepared spore suspension was inoculated into carrots (cv. Chamjoeun) at the 7−8 leaf stage. The disease incidence was investigated as disease index 2 weeks after inoculation.

각 지역에서 분리한 병원균의 특성

평창, 구미, 제주의 세 지역에서 분리한 A. dauci 균주 집단의 평균 균사 생장 정도는 Table 2에서 보는 것과 같이 지역 간에 통계적인 유의한 차이가 없었다. 하지만 평창, 구미, 제주 지역 균주 집단의 평균 포자 형성량은 2.8×10⁵, 1.6×10⁵, 0.8×10⁵ 개/ml로, 평창 지역 균주의 포자 형성량이 가장 많았으며, 제주 지역 균주의 포자 형성량이 적었다. 위도가 높은 평창에서 분리한 균주 집단이 위도가 낮은 제주 지역 균주 집단보다 포자 형성량이 많았다. 세 지역에서 분리한 170개의 균주 중에서 구미에서 분리한 A. dauci CDSGM9-2 균주가 9.3×10⁵ 개/ml로 가장 많은 포자를 형성하였다. 하지만 온도의 변화와 통기 및 자외선 처리를 하였음에도 불구하고 평창에서 분리한 균주 중에서 8균주가, 구미 균주 중단에서는 4균주가, 그리고 제주 균주 중에서는 8개의 균주는 포자가 형성되지 않았다. Rodrigues 등(2010)은 A. solani의 포자 형성을 위해서 확립한 조건이 감자와 토마토에서 분리한 30개의 균주에도 적용할 수 있는지를 실험한 결과, 7개 균주가 균사 생장을 위해서 사용한 V8 juice 액체 배지에서 배양이 되지 않아 포자 형성이 실패하였고, 나머지 23개 균주만이 포자를 형성하였다고 보고하였다. 본 실험에서는 사용한 전체 균주의 88.2%인 150개 균주가 포자를 형성하였으며, 지역 균주 집단의 평균 포자 형성량에는 통계적인 차이가 있었다. 평창 균주 집단에서 11균주, 구미에서 6균주, 제주에서 8균주를 선발하여 ‘Chamjoeun’ 품종에 대한 병원성을 검정한 결과(Fig. 5), 각 지역의 평균 발병률에는 통계적인 유의성이 없었다. 이처럼 배지에서 형성된 포자의 병원성에는 차이가 없었지만, 포자 형성량에는 통계적으로 유의한 차이가 있었기 때문에, 병원균의 대표 균주를 선정하기 위해서는 다양한 균주를 사용하여 포자 형성 능력과 병원성 등과 같은 다양한 특성을 조사한 후에 결정해야 할 것으로 생각한다.

Table 2.

Mycelial growth and spore production of Alternaria dauci on PDA

Fig. 5.

Disease incidence of Alternaria dauci isolated from each region. As for the pathogens used in the experiment, 11 isolates from Pyeongchang, 6 isolates from Gumi, and 8 isolates from Jeju were selected randomly. The result of the experiment was the average disease incidence of all isolates used in each region.

이상의 결과에서 보는 것처럼 본 연구의 포자 형성 방법을 따라 A. dauci를 배양한다면, 특성이 균일한 포자를 대량으로 얻을 수 있기 때문에, 병원균을 접종해야 하는 여러 가지 연구에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 생각한다.