Res. Plant Dis > Volume 29(1); 2023 > Article
콩균핵마름병균에 대한 병원성 검정법 확립

요 약

콩 균핵마름병을 일으키는 Macrophomina phaseolina의 병원성 평가를 위하여 실험실과 온실 검정법을 확립하였다. 실험실 검정에서는 소립균핵과 균사를 접종원으로 사용하였다. 소립균핵을 접종원으로 사용한 실험실 검정에서 M. phaseolina NSW17-108과 HSM17-034의 발병도는 25° C보다 35° C에서 더 높았다. NSW17-108과 HSM17-034 중에서 참깨에서 분리된 HSM17-034의 발병도가 콩에서 분리된 NSW17-108보다 높았다. M. phaseolina의 균사를 접종원으로 사용한 경우, NSW17-108과 HSM17-034는 35° C에서의 발병도가 접종 5일 만에 80%를 상회하였다. HSM17-034는 25° C에서의 발병도가 접종 5일 후에 80%를 상회하였다. 온실의 병원성 검정에는 소립균핵이 형성된 이쑤시개 또는 potato dextrose agar 배지에서 수확한 소립균핵 자체를 접종원으로 사용하였다. 모든 온실 검정에서 M. phaseolina NSW17-10과 HSM17-034는 접종 방법에 따라 병원균을 접종하고 35-65일 후에 40-60%의 발병도를 보였다. 두 균주 중에서 HSM17-034의 병원성이 NSW17-108보다 강했으며, 이 결과는 실험실 검정 결과와 일치하였다. 본 연구에서 확립한 실험실 및 온실 검정법은 각 방법에 따라 장단점이 있기 때문에, 연구의 목적에 부합할 수 있는 시험법을 선택하여 사용하는 것이 필요하다.

ABSTRACT

The establishment of a laboratory assay and a greenhouse assay was conducted for evaluating the pathogenicity of Macrophomina phaseolina causing soybean charcoal rot established. In the laboratory assay, microsclerotia and hyphae were used as inoculum. In the laboratory assays using microsclerotia as an inoculum, disease incidences of M. phaseolina NSW17-108 and HSM17-034 were higher at 35 o C than 25 o C. Of the two isolates NSW17-108 and HSM17-034, the disease incidence of HSM17-034 isolated from diseased sesame is higher than that of NSW17-108 isolated from diseased soybean. When the mycelia of M. phaseolina were used as an inoculum, the disease incidence of NSW17-108 and HSM17-034 at 35°C exceeded 80% even after only 5 days of inoculation. Even at 25°C, furthermore, that of HSM17-034 exceeded 80% 5 days later. In the pathogenicity assays at a greenhouse, toothpicks where microsclerotia were produced or microsclerotia harvested from potato dextrose agar medium were used as an inoculum. In all greenhouse assays, M. phaseolina NSW17-108 and HSM17-034 showed 40-60% of disease incidences 35-65 days after inoculation with the pathogen, depending on the inoculation method. Between the two isolates, the pathogenicity of HSM17-034 was stronger than that of NSW17-108, and this result was consistent with laboratory assay results. Since the laboratory and greenhouse test methods tested in this study have different advantages and disadvantages depending on each test method, it is thought that the test method that can meet the purpose of the study should be selected and used.

서 론

콩 생산을 위협하는 뿌리에 발병하는 진균병에는 검은뿌리썩음병, 시들음병, 균핵마름병 등이 있다(Berggren과 Snow, 1989; Díaz Arias등, 2013; Ko 등, 2020; Romero Luna 등, 2017). Macrophomina phaseolina에 의해서 발생하는 균핵마름병은 다른 진균병과는 다르게 고온 건조한 기후에서 심한 피해가 유발되며, 병원균은 건조한 토양 상태에서 10개월 이상 생존이 가능하다고 알려져 있다(Khan, 2007; Sánchez 등, 2017; Short 등, 1978). 미국의 경우, 콩 재배 지역에 따라서 발생하는 주요 병이 다른 양상을 보이는데, 미국 북부 지역은 콩 시스트선충에 의한 피해가 큰 반면에, 남부 지역은 M. phaseolina에 의한 charcoal rot의 피해가 크다(Allen 등, 2017). 그런데 기후 변화로 인하여 기온이 상승하면서, 미국의 중북부 지역과 캐나다 온타리오와 같은 지역에서도 charcoal rot의 발생이 문제가 되고 있다. 국내의 농업 기후에도 변화가 있는데, 1981년 11.5° C이었던 연 평균 기온이 2021년에는 13.6° C로 평균 2° C 증가하였다(Korea Meteorological Administration, 2022). 콩 재배 면적은 1981년 20만 1천 ha에서 2021년에는 5만 4천 ha로 약 73%가 감소하였지만, 콩을 재배하는 논 면적의 비율은 1981년 5.3%에서 2021년에는 19.6%로 증가하였다(Korean Statistical Information Service, 2022). 논 토양 재배지의 경우, 넓게 경지정리 되어있는 지역에서 대규모 단지를 형성하고 있고, 스마트팜에 대한 정책적인 지원으로 지상부뿐만 아니라 토양에 대한 농작업이 기계화됨에 따라서, 토양병원균인 M. phaseolina에 의한 콩 균핵마름병의 피해는 심해질 것으로 예상된다.
이처럼 기후 변화와 재배 환경의 변화로 피해가 심해질 것으로 예상되는 M. phaseolina에 의한 균핵마름병의 방제를 위한 연구가 필요한 시점이지만, 국내에서 M. phaseolina에 대한 연구는 부족한 상황이다. M. phaseolina를 방제하기 위한 방법으로는 살균제 처리, 저항성 품종의 재배, 토양에 대한 태양열 소독, 관수 조절, 타 작물과의 윤작 등 여러 가지 방법이 있다(Marquez 등, 2021). 포장에서 다양한 방법으로 방제를 수행하기 위해서는, 실내 및 온실에서 병원성 검정법이 확립되고, 여러 가지 방제 방법에 대한 효과가 확인될 필요가 있다. 따라서 본 연구에서는 M. phaseolina의 병원성과 살균제 효과 검정 등을 수행할 수 있는 실내와 온실 검정법을 확립하고자 하였다.

재료 및 방법

실험에 사용한 병원균.

M. phaseolina의 병원성 검정법 확립을 위해서 콩에서 분리된 M. phaseolina NSW17-108과 참깨에서 분리된 M. phaseolina HSM17-034를 선발하여 실험하였다. 병원균은 potato dextrose agar (PDA) 사면 배지에 접종하여 30° C에서 3일간 배양한 후 4° C에서 보관하며 실험에 사용하였다.

실험에 사용한 콩 품종 및 종자 준비.

모든 실험에는 대원콩 종자를 사용하였다. 실험에 사용하기 전에 모든 종자는 70% 에탄올에서 30초, 2% 차아염소산나트륨 용액에서 6분간 종자 소독한 후, 멸균수로 3회 세척하여 사용하였다. 표면소독한 콩 종자는 멸균수에 적신 멸균한 탈지면을 넣은 식물 배양 접시에 올려 25° C 배양기에서 4일간 최아시켜 사용하였다.

병원균의 접종원 준비.

병원균의 병원성 검정을 위한 접종원으로는 M. phaseolina의 소립균핵, 균사, 소립균핵이 형성된 이쑤시개 등을 사용하였다. 병원균의 소립균핵 확보를 위해 M. phaseolina를 PDA 배지에 접종하여 암 상태의 30° C 에서 3일간 배양하였다. 병원균의 균총 선단에서 직경 5 mm 의 균사 조각을 떼어내어 멸균한 셀로판지를 올려놓은 새로운 PDA 배지에 다시 접종하고, 30° C 암조건에서 7일간 배양하였다. 셀로판지 위에 형성된 소립균핵을 멸균한 붓으로 수확하고, 25° C에서 7일간 건조시킨 후 4° C에서 보관하면서 접종원으로 사용하였다(Fig. 1A). 접종원으로 사용하는 균사체를 준비하기 위해서 병원균을 PDA 배지에 접종하고 30 o C에서 3일간 배양한 후, 균총의 선단부에서 직경 5 mm의 균사 조각을 떼어내어 접종원으로 사용하였다(Fig. 1B). 온실 검정에서 사용한 소립균핵이 형성된 이쑤시개를 준비하기 위하여 이쑤시개를 12 mm 길이로 자른 후, 121° C에서 30분 동안 1일 간격으로 총 2회 멸균하였다. 멸균한 이쑤시개는 300 μ g/ml의 streptomycin을 첨가한 PDA 배지에 10개씩 치상하였다. PDA 배지에 접종하여 30° C에서 3일간 배양한 M. phaseolina의 균총에서 직경 5 mm의 균사 조각을 떼어내어 이쑤시개를 올려놓은 PDA 배지에 6개씩 접종하였다(Fig. 1C). 병원균은 30° C 의 암 조건에서 5일간 배양하고, 이쑤시개 표면에 병원균의 소립균핵이 형성되었음을 확인한 후, 접종원으로 사용하였다(Fig. 1D).
Fig. 1.
Inoculum used in laboratory and greenhouse assay. (A) Microsclerotia formed after culturing for 7 days in a potato dextrose agar (PDA) medium at 30 o C. (B) Mycelial colonies cultured in PDA medium at 30 o C for 3 days. (C) Sterilized toothpicks placed on a PDA medium for culturing Macrophomina phaseolina to prepare the inoculum used in the greenhouse test. (D) Toothpicks with microsclerotia used as an inoculum in the greenhouse test. Red arrows are toothpicks with microsclerotia.
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실내 병원성 검정법 확립.

실내에서 병원성 검정은 병원균의 소립균핵과 균사를 접종원으로 사용하여 실험하였으며, 식물 배양 접시(직경; 100 mm, 높이; 40 mm, SPL Life Sciences, Pocheon, Korea)와 50 ml conical tube (H20050, HYUNDAI MICRO, Seoul, Korea)에서 실시하였다.
식물 배양 접시와 conical tube에서 M. phaseolina NSW17-108의 소립균핵을 12.5 mg/l의 농도로 혼합한 0.8% water agar (WA) 배지의 분주 위치가 병원성에 미치는 영향을 조사하였다. 식물 배양 접시를 사용하여 실험할 경우, 소립균핵을 현탁한 WA를 식물 배양 접시의 상층(Fig. 2A), 하층(Fig. 2B), 중층(Fig. 2C) 부위에 부어 병원성 검정에 사용할 WA 배지를 준비하였다. WA 배지에는 표면소독 후 최아 시킨 대원콩 종자 5립을 치상하여 재배하였다. Conical tube를 사용할 경우에도 소립균핵을 현탁한 0.8% WA 배지를 위치 별로 부어 접종하였다. 0.8% WA 배지 위에 콩 종자를 치상하고 소립균핵을 현탁한 WA 배지를 종자에 부어준 경우(Fig. 3A), 소립균핵을 현탁한 WA 배지를 conical tube에 붓고 그 위에 종자를 치상한 경우(Fig. 3B), 발아한 콩을 2일간 재배한 후에 소립균핵 현탁 WA 배지를 콩의 지제부에 부어준 경우(Fig. 3C)로 나누어 실험하였다. 식물 배양 접시와 conical tube에서 병원균을 접종한 콩은 35° C (14 hr/10 hr, L/D)에서 재배하며 발병을 유도하였다. 실험은 완전임의배치 3반복으로 수행하였으며, conical tube를 사용한 경우에는 한 반복에 8개의 conical tube를 사용하였다. 또한 콩에서 분리된 M. phaseolina NSW17-108과 참깨에서 분리된 M. phaseolina HSM17-034의 병원성 검정과 발병 온도가 각 균주의 병원성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 식물 배양 접시와 50 ml conical tube에서 실험하였다. 이때 발병 온도는 25° C와 35° C로 각각 조절하여 실험하였다.
Fig. 2.
Inoculation location of microsclerotia of Macrophomina phaseolina in a pathogenicity assay through a microsclerotia inoculation in a plant culture dish. (A) Upper layer. (B) Lower layer. (C) Middle layer. (D) Non-inoculated control. Number 1 shows a 0.8% water agar medium with the addition of microsclerotia, and num-ber 2 shows a water agar medium without the addition of microsclerotia.
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Fig. 3.
Inoculation location of microsclerotia of Macrophomina phaseolina in a pathogenicity assay through a microsclerotia inoculation in a 50 ml conical tube. The location of the inoculum was the same layer as the seed (A), the lower layer of the seed (B), the stem of the soybean (C), and the non-inoculated control (D).
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서로 다른 기주에서 분리된 M. phaseolina NSW17-108과 HSM17-034의 균사를 접종원으로 사용하여 실험하였다. 병원균을 PDA 배지에 접종하여 30° C에서 3일간 배양한 후, 균총의 선단부에서 직경 5 mm의 균사 조각을 떼어내어 접종원으로 사용하였다. 병원균의 균사를 0.8% WA 배지를 부어준 식물 배양 접시에 접종하고, 30° C에서 병원균이 배지 표면의 70%까지 자라도록 배양하였다. 배지 표면의 70%까지 균사가 생장한 상태에서, 균총의 가장자리에 콩 종자를 일정한 간격으로 배양 접시 한 장에 5립씩 치상하였다. 콩 종자를 치상한 배지는 25° C와 35° C 배양기(14 hr/10 hr, L/D)로 옮겨서 배양하며, 발병을 유도하였다. 실험은 완전임의배치 3반복으로 수행하였다.

실내 검정에서 발병 조사.

소립균핵과 균사를 접종하는 실내 검정에서는 병원균을 접종하고 3, 5, 7, 10일 후에 Fig. 4의 발병지수로 병 발생 정도를 조사하였다. 조사한 발병지수를 아래 식에 대입하여 발병도를 계산하였다.
발병도(%)=(i=0t(i×ni)/t×N)×100
Fig. 4.
Disease index to evaluate the disease incidence of soybean charcoal rot caused by Macrophomina phaseolina. 0, healthy; 1, reddish or browning root 0%≤x<50%, no cotyledon red or browning; 2, reddish or browning of root 0%≤x<50%, red or browning of cotyledons 0<x<50%; 3, reddish or browned root 0%≤x<50%, cotyledon red or browned 50%≤x≤100%; 4, reddish or browning root 50%≤x<80%, no cotyledon red or browning; 5, reddish or browned root 50%≤x<80%, cotyledon red or browned 0<x<50%; 6, reddish or browning of root 50%≤x<80%, red or browning of cotyledons 50%≤x≤100%; 7, red or browning root 80%≤x≤100%, cotyledon red or browning 100%.
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i: 발병지수, t: 발병지수 최댓값
ni: 발병지수가 i인 콩의 갯수, N: 실험에 사용한 콩의 전체 갯수

온실 병원성 검정법 확립.

온실에서 병원성 검정은 Das 등(2012)의 방법을 개선한 이쑤시개 접종과 소립균핵의 종자 분의 및 토양 관주 접종으로 수행하였다.
이쑤시개 접종을 위해서 표면 살균한 대원콩 종자를 식물 재배 포트(직경, 9 cm; 높이, 8.8 cm)에 1립씩을 파종한 후, 삼출엽이 나오는 V1 성장기까지 온실에서 재배하였다(Das 등, 2012). 소립균핵이 형성된 이쑤시개로 콩의 줄기가 부러지지 않도록 지제부의 줄기가 관통하도록 찔러 접종하고, 상토로 접종 부위를 덮어 주었다. 병 발생을 위해서 3일에 1회씩 관수하며 관리하였다. 실험은 온실에서 난괴법 9반복으로 실험하였다.
소립균핵의 종자 분의 접종 시 소립균핵의 접종량이 병 발생에 미치는 효과를 M. phaseolina NSW17-108과 HSM17-034 균주를 사용하여 실험하였다. 표면 소독한 대원콩 종자 1개당 0.1, 0.5, 2.0 mg의 소립균핵을 각각 분의 처리하여 접종한 후, 포트(직경, 14 cm; 높이, 16 cm)에 3립씩 파종하였으며, 3일에 1회 관수하였다. 모든 실험은 난괴법 9반복으로 실시하였으며, 콩 3립을 파종한 한 포트를 한 반복으로 하여 처리당 9반복으로 실험하였다.
소립균핵의 현탁액을 만들어 M. phaseolina NSW17-108과 HSM17-034의 병원성 검정을 실시하였다. 표면 소독한 대원콩 종자를 포트(직경, 9 cm; 높이, 8.8 cm)에 2립씩 파종하여 본엽이 나온 VC기까지 재배하였다. 병원균의 소립균핵을 100 ml 증류수에 4.0 mg씩 현탁하여 VC기까지 재배된 콩 포트에 토양 관주하여 접종하였다. 병원균을 접종한 콩은 3일에 1회 관수하며 발병을 유도하였다. 모든 실험은 콩 2립을 파종한 한 포트를 한 반복으로 하여 난괴법 9반복으로 실험하였다.

온실 검정에서 발병 조사.

무처리구에서 콩이 고사하게 되면, 재배하던 모든 콩의 성체를 뽑아 지상부와 지하부의 병징을 Fig. 5의 발병지수를 가지고 병 발생 정도를 조사한 후, 발병도를 계산하였다. 사용한 접종법과 실험한 계절의 기온 때문에 무처리구의 콩이 고사하는데까지 걸리는 기간이 달라서 조사하는 시기도, 이쑤시개 접종을 하였을 때에는 파종하고 35일 후에 병 발생을 조사하였다. 하지만 소립균핵을 종자 분의 접종 또는 토양 관주 접종하였을 때에는 65일 후에 병 발생을 조사하였다.
Fig. 5.
A disease index used in the assessment of charcoal rot development caused by Macrophomina phaseolina on a soybean plant. 0, healthy; 1, wilting of above ground parts; 2, wilting and browning of above ground parts; 3, wilting and browning of above ground parts and formation of microscopic sclerotia on roots; 4, wilting and browning of above ground parts and formation of microscopic sclerotia on roots and crown.
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결과 및 고찰

실내 검정에서 M. phaseolina 의 소립균핵 접종 위치가 병원성에 미치는 영향.

식물 배양 접시에서의 결과는 Fig. 6A와 B 와 같았다. 소립균핵이 현탁된 WA 배지를 위치별로 분주한 WA 배지에 콩 종자를 올려놓고 3일 후에 조사하였을 때는 세 가지 위치 모두에서 6.7-7.6%의 낮은 발병도를 보였지만, 5일 후에는 소립균핵 현탁 WA 배지를 실험 배지의 상층부에 접종하였을 때 68.6%, 중앙부에 접종하였을 때 65.7%, 그리고 배지 하층부에 접종하였을 때 55.2%로, 배지 하층부에 접종하였을 때의 발병도가 제일 낮았다. 하지만 7일 후에는 세 가지 위치 모두에서 71.4-72.4%의 발병도를 보였고, 처리 간에 통계적인 유의성은 없었다. 하지만 소립균핵을 현탁한 WA 배지를 실험 배지의 상층부에 분주하고, 그 위에 종자를 치상하였을 때, 균핵마름병이 가장 빠르게 발생하였다. Conical tube에서 실험하였을 때, 콩 균핵마름병의 발병도는 식물 배양 접시에서보다 전체적으로 낮았다(Fig. 6C, D). 병원균의 소립균핵을 접종하고 10일이 지난 후에 병 발생 정도를 조사한 결과, 소립균핵을 첨가한 WA 배지 위에 종자를 올려놓고 재배한 경우의 발병도가 52.4%로 가장 심하였고, WA 배지 위에 치상한 종자에 소립균핵을 접종한 WA 배지를 부어 접종한 처리구에서는 40.9%, 콩 유묘의 지제부에 소립균핵 현탁 WA 배지를 부어 접종한 처리구에서는 34.5%로 나타났다. 식물 배양 접시와 conical tube를 이용한 실험 모두에서 소립균핵을 종자에 직접 접촉할 수 있게 접종한 경우에 병 발생이 심하였다. 콩 유묘의 지제부에 소립균핵을 접종하였을 때는 Fig. 6C에서처럼 병 발생이 적은 것을 보면, M. phaseolina는 유묘의 어린 줄기보다는 종자나 유근을 더 쉽게 침입함을 알 수 있었다.
Fig. 6.
Pathogenicity assay using the microsclerotia inoculation method for Macrophomina phaseolina causing soybean charcoal rot. (A) Disease incidence of M. phaseolina NSW17-108 investigated by using microsclerotia inoculation method in plant culture dishes. (B) The results of an experiment investigating the disease incidence of M. phaseolina NSW17-108 in a plant culture dish by the microsclerotia inoculation method. (C) Disease incidence of M. phaseolina NSW17-108 by using microsclerotia inoculation method in plant culture dishes. (D) The results in a conical tube. The numbers indicate the method of inoculating the pathogen. In A and B, no. 1 represents the treatment in which water agar (WA) medium containing microsclerotia was added to the top, no. 2 represents the treatment poured at the bottom, and no. 3 represents the treatment poured in the center. In C and D, no. 1 refers to the treatment in which WA medium was added to the seed placed on the WA medium without microsclerotia, and No. 2 refers to the treatment in which microsclerotia was added to the WA medium on which the seed was placed. And no. 3 refers to the treatment in which WA medium with the inoculum was added to the soybean seedling at the lower part of the stem. CK represents the control not inoculated with pathogens. All treatment means were separated using Duncan's multiple range test according to the fungicide used in the experiment. Treatments with the same letters are not statistically different at P≤0.05.
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소립균핵 접종 실내 검정에서 M. phaseolina 의 균주와 발병 온도가 병원성에 미치는 영향.

콩에서 분리된 M. phaseolina NSW17-108과 참깨에서 분리된 M. phaseolina HSM17-034의 병원성을 식물 배양 접시에서 실험하였다(Fig. 7A). 식물 배양 접시에서 병원균을 접종하고 7일 후에 발병도를 조사한 결과, NSW17-108을 접종한 콩은 25 o C에서 20.0%, 35° C에서는 72.4%의 발병도를 보였으며, HSM17-034 균주를 접종한 콩에서는 25 o C에서 48.6%, 35° C에서는 86.7%의 발병도를 보였다(Fig. 8A). 콩에 NSW17-108과 HSM17-034 균주를 각각 접종했을 때, 두 균주 모두 25° C보다는 고온인 35° C에서 병 발생이 심하였으며, 균주 간에는 참깨에서 분리한 HSM17-034이 콩에서 분리된 NSW17-108보다 콩에 대한 병원성이 강하였다. 실험에 사용한 M. phaseolina 두 균주의 콩에 대한 병원성을 50 ml conical tube에서 실시하였다(Fig. 7B). 접종한 지 7일 후에 NSW17-108의 발병도는 25° C에서 28.0%, 35° C에서 64.9%, HSM17-034의 발병도는 25° C에서 39.9%, 35° C에서 69.6%로, 동일한 시기에 조사한 식물 배양 접시 검정법보다 발병도가 낮았다(Fig. 8B). 하지만 10일 후에 25° C와 35° C에서 조사한 발병도는 다시 증가하여 NSW17-108은 43.5%와 78.6%, HSM17-034는 58.9%와 87.5%로 증가하였다. 식물 배양 접시를 이용한 병원성 검정법과 비교했을 때, 50 ml conical tube를 이용한 검정법에서는 온도에 따른 병원성은 통계적으로 유의한 차이가 있었으나, 참깨에서 분리된 HSM17-034과 콩에서 분리된 NSW17-108의 균주 간에는 통계적인 유의 차이가 없었다. 또한 접종 후 동일한 시기에 조사한 콩에 대한 발병도가 식물 배양 접시에서보다 낮았다.
Fig. 7.
In vitro pathogenicity test using three inoculation methods. (A) Microsclerotia inoculation method in a plant culture dish. (B) Microsclerotia inoculation method in a conical tube. (C) Mycelial inoculation method. All pictures were taken 7, 10, and 7 days after inoculation with Macrophomina phaseolina NSW17-108 and HSM17-034 isolated from diseased soybean and sesame, respectively.
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Fig. 8.
Disease incidence of Macrophomina phaseolina NSW17-108 and HSM17-034 in in vitro pathogenicity tests using three inoculation methods. (A) Microsclerotia inoculation method using a plant culture dish. (B) Microsclerotia inoculation method using conical tube. (C) Mycelial inoculation method. M. phaseolina NSW17-108 was a pathogen isolated from diseased soybean plant, and HSM17-034 was a pathogen isolated from diseased sesame plant. All treatment means were separated using Duncan's multiple range test according to the fungicide used in the experiment. Treatments with the same letters are not statistically different at P≤0.05.
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실내 검정법은 토양 병원균의 병원성 검정을 위해서 많은 연구에서 사용되고 있다(Basbagci 등, 2019; Benavent-Celma 등, 2021; Rahayu, 2014). 실내 검정법에서 소립균핵 접종법은 병원균의 소립균핵 수확을 위해서 시간과 노력이 많이 필요한 검정법이다. 하지만 소립균핵 접종법은 균핵마름병의 주된 전염원으로 토양이나 병든 기주식물의 조직에 있는 소립균핵을 PDA 배지에서 인위적으로 형성시켜 수확한 후, 배지에 접종하여 병원성을 검정하기 때문에, 실내 검정법인데도 불구하고 포장과 유사한 조건에서 검정하는 장점을 갖는다(Baird 등, 2003; Gupta 등, 2012; Meyer 등, 1974). Conical tube를 사용할 경우, 식물 배양 접시를 사용하는 경우보다 시간과 노력이 더 많이 필요하지만, 종자의 오염이 심하였던 식물 배양 접시에 비교하면 종자의 오염도가 많이 감소하는 장점이 있었다. 소립균핵을 접종하는 실내 검정법을 식물 배양 접시나 conical tube를 사용할 경우, 살균제의 종자 처리 효과의 검정이 가능하지만, 발병도가 상대적으로 낮은 conical tube 검정법에서는 살균제의 방제 효과가 확대 해석될 수 있는 단점이 있다.
NSW17-108과 HSM17-034의 균사를 각각 접종한 WA 배지에서 콩에 대한 병원성을 검정하였다(Fig. 7C). 종자를 치상하고 5일간 배양한 후 발병도를 조사한 결과, NSW17-108은 25 o C와 35 o C에서 각각 29.5%와 85.7%이었으며, HSM17-034는 82.9%와 93.3%이었다(Fig. 8C). 이는 소립균핵을 접종한 식물 배양 접시에서 7일 후에 조사한 발병도보다도 높거나 비슷한 결과로서, 균사 접종의 경우가 병 발생이 빠르고 용이함을 알 수 있었다. M. phaseolina의 콩에 대한 병원성도 사용한 두 균주 모두 25° C보다 35° C에서 강하였으며, 참깨에서 분리된 HSM17-034가 콩에서 분리된 NSW17-108보다 강하였다.
소립균핵 검정법과 비교하여 균사 접종법은 검정용 배지를 준비하는데 매우 간편하여 많은 토양 병원균의 병원성 검정에 사용되고 있다(Basbagci 등, 2019; Benavent-Celma 등, 2021). 하지만 균사가 배지의 표면에서 균일하게 생장한 후에 종자를 치상하기 때문에, 생장이 왕성한 균사가 종자나 발아한 유근과 직접 접촉하여 쉽게 침입하게 되고, 병 발생이 심한 경향이 있으며, 그러다보니 살균제 종자 처리 효과가 과소 평가되는 단점이 있었다.

이쑤시개 접종을 이용한 온실 검정법.

M. phaseolina NSW17-108을 접종한 처리와 HSM17-034을 접종한 처리구에서의 발병도는 각각 52.8%, 69.4%로, 참깨에서 분리된 균핵마름병균을 접종한 처리구의 발병도가 더 심하였다(Fig. 9). 실험에 사용한 균핵마름병균 균주 간의 발병도는 95% 수준에서 통계적인 유의성이 인정되었다. 이쑤시개 접종법은 접종원 준비는 가장 용이하였지만 이쑤시개를 식물체 지제부에 직접 찔러서 접종하기 때문에 짧은 시간에 병이 심하게 발생하는 특징을 보이면서, 살균제 종자 처리 효과를 검정할 수 없는 단점이 있었다.
Fig. 9.
Incidence of Macrophomina phaseolina NSW17-108 and HSM17-034 in greenhouse pathogenicity tests using toothpick inoculation method. The difference between the two isolates was statistically analyzed by t-test. *Significant at P<0.05.
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소립균핵 종자 분의 접종을 통한 온실 검정법.

소립균핵을 종자 분의 처리하여 접종할 때, 종자에 분의 접종하는 M. phaseolina NSW17-108과 HSM17-034의 소립균핵의 양이 병 발생에 미치는 영향을 조사하였다(Fig. 10). 소립균핵을 분의 접종한 종자를 파종하고 35일 후에 발병도를 조사하였을 때, 소립균핵의 양이 0.1과 0.5 mg/seed의 경우, NSW17-108과 HSM17-034의 발병도는 통계적으로 유의성이 없었다(Fig. 11). 하지만 분의 접종하는 소립균핵의 양이 2.0 mg/seed일 경우, NSW17-108과 HSM17-034의 발병도는 40.0%와 65.8%로, 0.1과 0.5 mg/seed 의 처리보다 높았으며, 통계적으로 유의성이 인정되었다.
Fig. 10.
Incidence of Macrophomina phaseolina NSW17-108 and HSM17-034 in greenhouse pathogenicity tests using toothpick inoculation method. The difference between the two isolates was statistically analyzed by t-test.
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Fig. 11.
Disease incidence of Macrophomina phaseolina NSW17-108 causing soybean charcoal rot according to the amount of microsclerotia in the seed dressing inoculation method with microsclerotia. All treatment means were separated using Duncan's multiple range test according to the fungicide used in the experiment. Treatments with the same letters are not statistically different at P≤0.05.
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소립균핵 토양 관주 접종을 통한 온실 검정법.

NSW17-108과 HSM17-034을 접종하고 59일 후 병 발생 정도를 조사하였을 때, 45.8, 52.8%로 참깨에서 분리된 HSM17-034가 콩에서 분리된 NSW17-108보다 발병도가 높았다(Fig. 12). 참깨와 콩에서 분리한 병원균의 발병도 차이는 95% 수준에서 유의성이 인정되었다.
Fig. 12.
Incidence of pathogenicity tests in a greenhouse using microsclerotia soil drench inoculation method. (A) Percentage incidence of charcoal rot on soybean inoculated with soybean and sesame isolates. (B) Symptoms of charcoal rot on soybean. The difference between the two isolates was statistically analyzed by t-test. *Significant at P<0.05.
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병원균의 소립균핵을 접종법으로 사용할 경우, 콩을 재배하는 포장과 가장 유사한 환경에서 실험이 될 수 있으나 접종원 준비에 많은 시간과 노력이 필요하다. 소립균핵을 종자 분의 처리할 경우 병 발생이 확실하지만, 과다하게 발생할 위험성이 있고 살균제 종자 처리 효과 검정이 어려운 단점이 있다. 하지만 소립균핵을 물에 현탁하여 토양에 관주하여 접종하는 검정법의 경우, 포장과 유사한 환경에서 실험이 가능할 뿐만 아니라 종자 처리 효과의 검정이 가능한 장점을 지닌다.
온실 검정법의 경우 단기간 내에 효과를 얻을 수 있는 실내 검정법과는 다르게, 결과를 얻기까지는 병원균을 접종하고 30-60일 정도의 긴 시간이 필요하다. 또한 발병을 위해서 온실에서 콩을 재배하며 관수 횟수 등을 조절하고 관리해야 하는 노력도 필요하다. 따라서 연구에서 확립한 몇 가지의 병원성 검정법은 Table 1에서 보는 것과 같이 장단점을 지니고 있기 때문에, 실험 목적에 부합하는 방법을 선택하여 실험할 경우에 더 정확한 결과를 얻을 수 있을 것으로 생각한다.
Table 1.
Comparison of advantages and disadvantages of assay methods for investigating the pathogenicity and fungicide efficacy on Macrophomina phaseolina causing soybean charcoal rot
Assay methods Advantages Disadvantages
Laboratory assay Microsclerotia inoculation method Experimental conditions are the same as a field. It takes a long time to harvest microsclerotia.
Seeds used in experiments are easily contaminated.
(plant culture dish) It is possible to test the effect of seed treatment.
Microsclerotia inoculation method (conical tube) Experimental conditions are the same as a field.
It is possible to test the effect of seed treatment.
The seeds used in the experiment are less likely to be contaminated.
It takes a long time to harvest microsclerotia.
It takes a lot of time and effort to Inoculate pathogens.
There is a possibility that the seed treatment effect of the fungicide may be over-interpreted.
Mycelial inoculation method It is easy to prepare and inoculate the inoculum of the pathogen. Because of the over-occurrence of the disease, the seed treatment effect of the fungicide may be underestimated.
It is easy to develop the disease in seedlings of host plants.
It is possible to test the effect of seed treatment.
Greenhouse assay Toothpick inoculation method It is easy to prepare and inoculate the inoculum of the pathogen. Since inoculation is performed by sticking a toothpick into the ground part of stem, it causes severe wounds. This can potentially exacerbate the disease.
It is possible to test the effect of seed treatment.
Microsclerotia seed dressing inoculation method Experimental conditions are the same as a field. It takes a long time to harvest microsclerotia.
It is not available to test the effectiveness of fungicide seed treatments
The disease occurs in excess.
The disease occurs uniformly and reliably.
Microsclerotia soil drench inoculation method Experimental conditions are the same as a field. It takes a long time to harvest microsclerotia.
It is possible to test the effect of seed treatment.

NOTES

Conflicts of Interest

No potential conflicted interest relevant to this article was reported.

Acknowledgments

This study was carried out with the support of the Rural Development Administration's joint research project (Project No. PJ014956022022).

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