2016년 6월 경북 청도군 복숭아 과원에서의 금지병원체 의심시료 발견에 따라 청도군 지역의 복숭아 4과원(이서면 2과원, 화양읍 2과원)의 전수 나무에 대해 자두곰보병 발생 여부를 조사하였다. 또한 우리나라 핵과류 과원을 대상으로 국내 자두곰보병 발생 조사 및 발생 시 방제를 위해 국립농업과학원을 포함한 농촌진흥청, 각 시군 센터를 포함한 도농업기술원 협업으로 2016년 7월 8개 도의 총 869과원(경기도 101과원, 강원도 100과원, 충북 100과원, 충남 101과원, 전북 100과원, 전남 94과원, 경북 172과원, 경남 101과원), 2017년 6월 8개 도와 4개 특별자치시 및 광역시의 총 1,146과원(경기도 100과원, 강원 100과원, 충북 189과원, 충남 90과원, 전북 105과원, 전남 180과원, 경북 180과원, 경남 102과원, 대전 25과원, 세종 30과원, 광주 20과원, 대전 25과원)에 대해 표본조사 하였다(Table 1, 2).

경북 청도군 복숭아 4과원의 555주 나무에서 나무 당 3잎 이상씩, 그리고 과실이 있는 경우 과실을 포함하여 115점, 246점, 163점, 31점, 총 555점의 시료를 수집하였다.

전국의 핵과류 과원 조사의 경우 8개 도, 1개 특별자치시, 3개 광역시의 핵과류 과원의 시료 채집은 과원 당 자두곰보병 의심 증상을 보이는 포장에서 양끝 열, 중간 열 총 3열이 조사되었다. 이상 증상 등을 고려하여 열 당 5주의 나무를 선정하고, 각 나무의 서로 다른 2개의 가지에서 각 1잎씩을 채집하였다. 2016년에는 열에서 10잎(5주)을 한 봉투에 담아 각 열 당 1점으로 과원 당 3점을 채집하였고, 복숭아 557과원의 8,260주 나무에서 1,652점, 매실 219과원의 3,345주 나무에서 669점, 자두 89과원의 1,315주 나무에서 263점, 체리 4과원의 60주 나무에서 12점이 수집되어 총 869 과원의 12,980주 나무에서 5주씩 묶음으로 하여 총 2,596점의 시료를 수집하였다(Table 1). 2017년에는 열에서 10잎 씩 3열에서 30잎(15주)을 한 봉투에 담아 과원당 1점을 채집하여, 8개 도, 4개 특별자치시 및 광역시의 복숭아 711과원의 10,665주 나무에서 711점, 매실 259과원의 3,885주 나무에서 259점, 자두 150과원의 2,250주 나무에서 150점, 살구 17과원의 255주 나무에서 17점, 체리 8과원의 120주 나무에서 8점, 플럼코트 1과원의 15주 나무에서 1점이 수집되어 총 1,146과원의 17,190주 나무에서 15주 묶음으로 총 1,146점의 시료를 수집하였다(Table 2).

1차 묶음 시료에 대한 자두곰보바이러스 유전자 검정 결과 양성인 경우 나무별 개별 검정을 위하여 자두곰보병 의심 나무의 사방 가지에서 2잎 이상씩 총 8잎 이상을 채집하였다. 2차 나무 개별에 대한 자두곰보병 검정 결과 양성인 경우, 자두곰보바이러스 감염 나무 주변 사방 8주의 나무에서 2차 개별 시료 채집과 동일한 방법으로 추가 시료를 채집하였다.

자두곰보바이러스 유전자 진단을 위하여 수집된 핵과류 10잎 또는 30잎에서 1.5 microtube 뚜껑(대략 15 mg)으로 의심 증상을 보이는 부분을 포함한 잎 당 3부위의 잎을 혼합한 후, 액체질소를 이용하여 막자와 막자사발로 마쇄하였다. Biocube를 이용한 게놈 추출 키트(BCS FP Kit, Biocubesystem Co.)를 이용하여 Total RNA를 추출하였으며, 추출된 Total RNA은 본 연구에서 제작된 자두곰보바이러스 coat protein 영역을 포함한 모든 계통을 진단할 수 있는 특이 프라이머 PPV-Det-Fw2 (5’ CAAGTGGAGTATCCAATAAAGCCATTG 3’), PPV-R (5’ CAAGGGCCTGTGTTCGACAATAA 3’)를 이용하여 Genetbio SuPrimeScript RT-PCR 2× Premix로 one step RT-PCR를 수행하였다. RT-PCR 조건은 50°C 30분, 95°C 5분, <95°C 30초, 50°C 30초, 72°C 1분>으로 40 cycle, 72°C 5분을 실시하여 바이러스를 진단하였다. 전기영동은 1× TBE buffer와 1% agarose gel에서 실시하였고, 분자량 마커로 100 bp DNA ladder를 이용하였다. 각각의 PCR 증폭 산물은 100 V에서 60분간 전기영동 후 UV transilluminator를 이용하여 결과를 확인하였다. 위와 같은 방법으로 8개 도원에서 수집된 1차 묶음 시료는 각 도 농업기술원에서 진단하였고, 경북 청도군 복숭아 4과원 시료, 광역시 및 세종특별자치 시료, 나무 개별로 채집된 시료는 농촌진흥청 국립농업과학원 작물보호과에서 진단하였다.

RT-PCR 결과 자두곰보바이러스 양성인 시료에서 약 547 bp PCR 산물을 정제 후 direct sequencing을 통하여 염기서열을 결정하였고, 미국국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 BLAST 분석 및 유연관계를 분석하였다.

2016년 6월 농림축산검역본부의 자두곰보병 발생 의심 농가 알림에 따른 육안 및 유전자 검정을 통한 경북 청도군 복숭아 4과원 555주 나무에 대한 전수조사를 하였다. 자두곰보바이러스 감염 현황을 조사하기 위하여 총 555점을 채집하여 유전자 진단을 실시한 결과, 복숭아 2과원의 각 1주의 나무에서 자두곰보바이러스 감염을 확인하였다(Table 3).

전국 핵과류 과원을 대상으로 국내 자두곰보바이러스 감염 현황을 조사하기 위해 2016년 8개 도 869과원의 12,980주 나무에서 2,596점의 시료를 수집하였다. 수집된 묶음 시료에 대한 자두곰보바이러스 유전자 검정을 실시한 결과, 13과원의 14점(복숭아, 매실 각각 7점) 시료에서 자두곰보바이러스 양성반응을 보였다. 나무별 개별 검정을 위하여 복숭아 7과원(경기 2과원, 충남 2과원, 전북 2과원, 경남 1과원)의 59주, 매실 6과원(경기 1과원, 충남 13과원, 전북 3과원, 경남 1과원)의 59주까지 총 13과원에서 118주 나무에 이상 증상을 보이는 잎 시료를 수집하여 유전자 검정을 실시하였다. 그 결과 복숭아 3과원(충남 2과원, 전북 1과원)의 4주, 매실 2과원(전북 1 과원, 경남 1 과원)의 3주, 총 핵과류 5과원 7주에서 자두곰보바이러스 감염을 확인하였다. 개별 검정을 통한 핵과류 7주의 자두곰보바이러스 감염 확정에 따라 감염 주 주변 8주, 총 50주(충남 2과원: 복숭아 24주, 전북 2과원: 복숭아 7주, 매실 8주, 경남 1과원: 매실 4주, 복숭아 6주, 자두 1주)에서 대한 추가적인 시료를 채집하였다. 충남 복숭아 과원의 경우 잎과 과실이 있는 경우 추가로 과실을 채집하여 검정하였다. 전북 복숭아 과원의 경우 주변에 8주의 나무가 존재하지 않아 7주의 나무만 채집되었고, 매실과원의 경우 잎이 남아 있지 않아 줄기를 채집하여 검정하였다. 경남 매실 과원 역시 주변의 8주의 나무가 존재하지 않아 매실, 복숭아, 자두 총 11주를 채집하여 검정하였다. 그 결과 복숭아 1주(충남 1과원), 매실 1과원(전북 1과원) 총 2주에서 추가로 자두곰보바이러스 감염을 확인하였다. 그 후 충남 복숭아 과원은 개별 및 추가 검정을 통해 전수가 조사되어 추가적인 조사를 하지 않았다. 전북 매실 과원의 경우 추가로 감염이 확인된 매실나무 주변 매실 8주에 대한 줄기 시료를 채집하여 자두곰보바이러스 유전자 진단을 한 결과, 추가적인 감염은 확인되지 않았다. 8개 도에서 총 869과원에 대한 1차 묶음, 개별 검정(12,980주), 2번의 주변 나무 검정(58주) 총 13,038주 나무에 대한 자두곰보바이러스 감염 조사 결과, 복숭아 3과원의 5주, 매실 2과원의 4주, 총 핵과류 5과원 9주에서 자두곰보바이러스 감염을 확인하였다. 2016년 경북 이서면 복숭아 4과원의 전수조사 및 전국 핵과류 869과원을 대상으로 표본조사 한 결과 총 7과원 11주(복숭아 7주, 매실 4주)에서 자두곰보바이러스 감염을 최종 확인하였다(Table 3).

전국 핵과류 과원을 대상으로 2017년 국내 자두곰보바이러스 감염 현황을 조사하기 위해 2016년 조사와 비교하여 핵과류 재배면적이 넓은 충북(189과원), 전남(180과원), 경북(180과원) 지역의 조사 과원이 늘어났고, 4개 특별자치 시 및 광역시의 핵과류 과원이 추가되었다(Table 2). 총 1,146과원의 17,190주 나무에서 1,146점의 시료를 수집하였다. 이 중 시료 보관 중에 문제로 매실 28과원(420주, 28점), 자두 6과원(90주, 6점) 총 34과원의 510주에서 수집된 시료 34점이 폐기되어 1,112과원의 16,680주 나무에서 1,112점의 수집된 묶음 시료에 대한 자두곰보바이러스 유전자 진단을 실시하였다. 그 결과, 6과원의 6점(복숭아 4점, 자두, 살구 각각 1점) 시료에서 자두곰보바이러스의 양성반응을 보였다. 나무별개별 검정을 위하여 복숭아 4과원(전북 4과원)의 60주, 자두 1과원(전북 1과원)의 15주, 살구 1과원 (전북 1과원)의 15주, 총 6과원에서 90주 나무에 이상 증상을 보이는 잎 시료를 수집하여 유전자 검정을 실시하였다. 그 결과 복숭아 1과원(전북 1과원)의 2주, 자두 1과원(전북 1과원)의 1주, 살구 1과원(전북 1과원)의 3주, 총 핵과류 3과원 6주에서 자두곰보바이러스 감염을 확인하였다. 개별 검정을 통한 핵과류 6주의 자두곰보바이러스 감염 확정에 따라 감염 주 주변 8주, 총 48주(전북 3과원: 복숭아 16주, 자두 8주, 살구 24주)에서 대한 추가적인 시료를 수집하였다. 그 결과 살구 4주(전북 1과원)에서 추가로 자두곰보바이러스 감염을 확인하였다. 추가로 자두곰보바이러스 감염이 확인된 살구 과원의 경우 개별 및 추가 검정(39주) 후 남은 전수인 살구 7주 및 개복숭아 5주, 총 12주에서 시료를 추가로 채집하여 검정하였고, 추가적인 감염은 확인되지 않았다. 전국 핵과류 과원을 대상으로 2017년 6월 8개 도, 4개 특별자치시 및 광역시의 총 1,112과원에 대한 1차 묶음, 개별 검정(16,680주), 2번의 주변 나무 검정(60주) 총 16,740주 나무에 대한 자두곰보바이러스 감염 조사 결과, 복숭아 1과원의 2주, 자두 1과원의 1주, 살구 1과원의 7주, 총 핵과류 3과원 10주에서 자두곰보바이러스 감염을 확인하였다(Table 3).

국내 유일 검역 금지급 바이러스병인 자두곰보병이 2015년 9월 국내 복숭아에서 보고됨에 따라(Oh 등, 2017), 2015년 10월 8개 도 16지역의 핵과류 과원에서 793점, 첫 발생지 인근 핵과류 과원에서 500점의 시료를 채집하여 자두곰보바이러스 진단 특이 프라이머를 이용하여 유전자 검정 한 결과 자두곰보바이러스 감염은 확인되지 않았다(미보고). 국내 식물방역법 제31조 등에 따라 국내 핵과류 과수원에 피해가 우려되는 자두곰보병의 조기 박멸과 국내 자 두곰보바이러스 감염 상황 조사를 위한 조사 지역, 시료 채취 및 검정 방법, 방제 등을 포함한 확산방지 전문가 회의, 워크숍 등이 개최되었다. 2016-2017년 6-7월경, 국립농업과학원을 포함한 농촌진흥청과 각 시·군 농업기술센터를 포함한 도 농업기술원의 협업으로 국내 핵과류 2,019과원에 대한 육안조사를 실시한 결과, 황화, 퇴록, 모자이크 등의 이상 증상은 관찰할 수 있었으나 원형 반점 등 자두곰보병의 뚜렷한 증상은 관찰되지 않았다. 자두곰보바이러스에 감염된 살구속 핵과류는 잎, 과실, 씨 표면의 원형 반점, 퇴록 반점, 엽맥 퇴록, 황화, 괴저, 모자이크 등 증상이 나타나며, 이러한 증상은 나무의 상태, 기후, 품종, 바이러스 발생 계통에 따라 많은 차이를 보인다고 보고되었다(Dunez와 Sutic, 1988; James 등, 2013). 세계적으로 22여 종의 바이러스가 복숭아에 발생하는 것으로 보고되었으며(Fauquet 등, 2005), 그 중 Apple chlorotic leaf spot virus, Prunus necrotic ringspot virus 등 7종이 단독, 혹은 복합적으로 발생하여 과수 수세를 약화시킨다고 보고되었다(Cho 등, 2012; Lim 등, 2015). 따라서 정확한 자두곰보병 발생 조사를 위해 2016년 경북 청도군 복숭아 과원의 전수조사 및 2016-2017년 8개 도, 4개 특별자치시 및 광역시의 표본조사를 통해 국내 핵과류 1,985과원의 30,333주 나무에 시료를 수집하여 자두곰보바이러스 감염 조사를 한 결과, 4개 도 5개 시·군의 10과원 21주(충남 2과원: 복숭아 4주, 전북 5과원: 복숭아 3주, 매실 2주, 자두 1주, 살구 7주, 경북 2과원: 복숭아 2주, 경남 1과원: 매실 2주)에서 자두곰보바이러스 감염을 확인하였으며, 박멸조치에 따라 감염 주에 대한 폐기 등 방제가 실시되었다(Fig. 1).

자두곰보바이러스 감염이 확인된 시료 중 2016년 복숭아 7점에 대한 PCR 산물을 정제 후 양방향의 direct sequencing (Genotech, Daejeon, Korea)을 통하여 평균 500 bp 정도의 염기서열을 결정하였다. 미국국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 BLAST 검색 결과, GenBank에 등록된 자두곰보바이러스 D 계통 분리 주들과 99% 염기서열 상동성을 보였다. 계통학적 유연관계를 분석하기 위하여 Geneious 8.1.9. 프로그램의 ClustalW, PHYML(K80, Bootstrap 100)을 사용하였고, 기존에 보고된 자두곰보바이러스 주요 계통인 D, M, Rec를 포함한 6계통 13개 분리 주와 비교 분석하였다. 2016년 국내 발생 자두곰보바이러스 분리 주 간에 98-100% 높은 염기서열 상동성을 보였고, 기존에 보고된 D 계통 복숭아 분리주(LC159485, 한국[2015], 복숭아), Ou1 분리주(AB109100, 일본, 매실), PENN1 분리주(AF401295, 미국, 복숭아), Vulcan 분리주(AY912057, 캐나다, 복숭아)와는 95-100% 상동성을 보였다. M 계통의 경우 89-94%, Rec 계통은 88-94% 상동성을 보였다. Phylogenetic tree 분석을 통한 13개 분리 주와 유연관계를 분석한 결과, D 계통과 높은 유연관계를 가지는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2).

본 연구는 2016-2017년 국내 복숭아, 매실 등 핵과류 과원의 자두곰보바이러스 감염 여부를 조사하고, 이를 바탕으로 국내 자두곰보병 박멸을 위한 발생 주 제거 등 예방 및 방제 대책 수립을 위한 기초자료로 활용하고자 수행되었다. 현재까지 국내에 보고된 D 계통은 즙액접종이 잘 되지 않으며, 진딧물에 의한 확산이 더딘 계통으로 알려져 있으나 자두곰보바이러스는 계통 간의 재조합(Rec 계통; D, M 재조합), 계통 안에서의 변이 발생 가능성이 높아 발생 시 위험한 병으로 알려져 있다(Dunez와 Sutic, 1988; James 등 2013; Maejima 등 2011). 또한 2016년 일본에서 병원성이 강하고 확산 속도가 빠른 M 계통이 발생함에 따라(Oishi 등, 2018) 자두곰보바이러스 감염 묘목 및 종자가 국내에 유입되지 않도록 해야하며, 지속적인 국내 자두곰보바이러스 발생, 계통 조사 및 자두곰보병 박멸을 위한 발생 원인 구명 등 추가적인 연구가 이루어져야 할 것으로 생각된다.