국내 기장과 수수에 발생하는 바이러스병 발생 실태를 조사하기 위해 2015년과 2016년 5월부터 10월까지 재배량이 많은 지역(강원도 횡성군, 영월군, 정선군, 경상북도 안동시, 의성군, 칠곡군, 예천군, 경상남도 밀양시, 충청북도 단양군, 전라북도 고창군, 전라남도 나주시, 여수시, 신안군, 영광군, 제주도 제주시)을 선정하여 전국적인 조사를 실시하였으며 기장의 경우 총 101점(Table 1), 수수의 경우 총 200점의 시료를 채집하였다(Table 2). 육안으로 관찰한 기장과 수수의 주요 병징으로는 황화, 줄무늬, 위축 등이었으며(Fig. 1) 채집한 시료는 초저온냉동고(-80°C)에 보관하여 실험에 사용하였다.

기장 및 수수에 발생하는 바이러스를 조사하기 위해 NGS 분석을 실시하였다. 15년도에 채집한 기장 60점의 시료와 수수 97점의 시료를 동량으로 소량씩 떼어낸 후 혼합하여 각각 1점의 시료로 만들었으며, 혼합시료는 액체질소를 이용하여 곱게 마쇄한 후 Easy-Spin Total RNA extraction Kit (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 total RNA를 추출하였다. 혼합시료에서 추출한 total RNA는 테라젠이텍스(Theragen Etex Bio Institute, Suwon, Korea)의 Illumina Hiseq-2500 (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) 장비를 이용하여 paired-end RNA sequencing을 실시하였으며 각각 10 Gbp (Giga base pair)의 데이터를 생산하였다. 생산된 raw read sequence 데이터는 씨더스(Seeders, Daejeon, Korea)에 분석을 의뢰하였으며, 씨더스에서 구축한 파이프라인을 이용하여 기존에 보고된 식물바이러스 염기서열과 상동성을 갖는 virus-like sequence를 선별하였다(Supplementary Fig. 1). 확보한 모든 contig은 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 BLAST를 통해 재확인하였다.

채집한 각각의 시료에서 바이러스의 감염여부를 확인하기 위해 기장 101점, 수수 200점의 시료에 대해 개별 진단을 실시하였다. 개별 시료에 대한 total RNA 추출은 위의 방법과 동일하게 실시하였으며, RNA sequencing 분석을 통해 확보한 contig을 바탕으로 각 바이러스(BVG, PDMV, RBSDV, RSV)에 대한 특이적 프라이머를 제작하였다(Table 3). RT-PCR은 2×RT-PCR Premix SR-8000 (Genetbio, Korea)을 이용하여 수행하였으며 2×premixture 10 µl에 forward primer (10 pmol) 1 µl, reverse primer (10 pmol) 1 µl, 증류수 7 µl, 주형 total RNA 1 µl를 첨가하여 최종적으로 20 µl의 반응액을 만들었다. RT-PCR 반응은 50°C에서 30분간 역전사 반응 후에 9°C 에서 10분간 처리하여 역전사효소를 불활성화 시켰으며, 95°C에서 30초, 55°C에서 30초, 72°C에서 1분간 35회 증폭한 후에 마지막으로 72°C에 5분간 처리하였다. 증폭된 PCR 산물은 0.5×TAE 버퍼를 이용하여 만든 1.5% 아가로즈겔을 EtBr (Ethidium bromide)로 염색한 후 전기영동(HOEFER, USA)하여 확인하였다.

NGS 분석을 통하여 수수의 경우 Rice black-streaked dwarf virus (RBSDV), 기장의 경우 RSV, RBSDV, Cereal yellow dwarf virus (CYDV), Maize yellow dwarf virus (MYDV)가 검출되었다(Supplementary Fig. 1). 기장에서 검출된 MYDV의 경우 NCBI BLAST를 통해 확인한 결과 최근 국내에서 보고한 신종바이러스인 Barley virus G (Zhao 등, 2016)로 확인되었다. CYDV는 Polerovirus 속에 속하는 바이러스로 RNA sequencing을 통해 획득한 contig의 BLAST 결과 기존에 보고된 CYDV 분리주들과 염기서열 상동성이 매우 낮은 것으로 확인되었다(Supplementary Fig. 1). 따라서 획득한 contig을 바탕으로 특이적 프라이머를 제작하였으며, RT-PCR 및 클로닝을 통해 전체 염기서열을 결정하였다(자료 미제시). 그 결과 모든 암호화된 단백질(Open Reading Frame, ORF)의 서열이 다른 Polerovirus 속에 속하는 바이러스들과 10% 이상 차이를 보이므로 국제 바이러스 분류위원회(International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)의 종 분류 기준에 따라 신종바이러스로 동정하였으며, Panicum distortion mosaic virus (PDMV)로 가칭하였다. RNA sequencing 분석을 통해 확보한 contig을 바탕으로 설계한 프라이머를 이용하여 전체 시료에 대해 개별 진단을 실시한 결과 수수의 경우 27점(13.5%)의 시료에서 RBSDV가 검출되었으며, 기장의 경우 BVG가 17점(16.8%), PDMV가 1점(1%), RBSDV가 4점(4%), RSV가 3점(3%)이 검출되었으며, 3점(3%)의 시료에서 BVG와 PDMV 그리고 7점(6.9%)의 시료에서 BVG와 RBSDV의 복합감염이 확인되었다. RSV와 RBSDV의 경우 애멸구(Laodelphax striatellus)에 의해 영속 전염 하는 바이러스로 1960년대에 국내에 대발생한 이후로 발생이 점점 감소하였으나 중국으로부터 애멸구의 대량비래로 인해 2000년대 이후 벼와 옥수수에서 발생이 지속적으로 보고되고 있으며(Jeong 등, 2012; Lee 등, 2008), 기장과 수수에서 RBSDV는 국내 첫 발생보고이다. 기장 및 수수에서 RSV와 RBSDV의 발생은 벼와 옥수수에서의 발생과 마찬가지로 애멸구의 대량비래와 함께 온난화로 인한 월동 애멸구의 밀도 증가가 원인인 것으로 예상된다.

수수의 경우 2015년도에 채집한 시료 중 밀양(7월)에서 채집한 시료 1점, 2016년도에 채집한 시료 중 안동(6월)에서 채집한 시료 1점과 의성(9월)에서 채집한 시료 25점에서 RBSDV가 검출되었다. 2000년대 이후 남부와 중부 지역을 시작으로 전라북도, 강원도 지역에서 벼 및 옥수수에 RBSDV 발생이 확인되었으며(Lee 등, 2005, 2006), 최근에는 경상남북도 지역의 옥수수 재배단지에서 RBSDV의 발생이 확인되었다(Lee 등, 2008). 이와 같이 벼와 옥수수의 경우 전국적으로 RBSDV의 발생이 확인되었으나 수수의 경우 전국적으로 채집한 시료를 대상으로 진단을 실시하였으나 경상도 지역에서만 발생이 확인되었다. 따라서 경상도 지역에서 재배 되고 있는 수수와 다른 지역에서 재배되고 있는 수수의 품종에 대한 저항성 비교와 지역별 애멸구의 밀도 변화 등을 확인하여 정확한 감염경로에 대한 조사가 필요할 것으로 보인다.

기장의 경우 수수와 다르게 다양한 지역에서 바이러스가 검출되었으며 대부분의 시료에서 바이러스가 단독감염되어 있으나 일부 복합감염된 시료도 확인되었다(Table 4). 기장에서 RBSDV는 밀양과 의성 그리고 고창에서 채집한 시료에서 감염이 확인되었지만 고창에서 채집한 시료 중 1점의 시료에서만 RBSDV가 검출되어 수수와 마찬가지로 경상도 지역에서 높은 감염률을 나타내었다. 또한 RSV는 밀양, PDMV는 의성에서 채집한 시료에서만 감염이 확인되었다. 최근 보고에 따르면 중국으로부터 서해안 지역에 애멸구의 대량 비래는 5월 말부터 6 월 초에 걸쳐 급격히 이루어지고 있으며 RSV 보독충율은 7.7%, RBSDV 보독충율은 4.4%인 것으로 나타났다(Jeong 등, 2012). 본 조사에서 RSV와 RBSDV가 감염된 시료는 모두 7, 8, 9월에 채집한 시료이며 애멸구의 대량 비래 후 지역적으로 이동하여 6월 중하순부터 본격적으로 애멸구로 인한 바이러스 감염이 이루어지는 것으로 보인다. BVG의 경우 의성, 여수, 영월, 고창, 영광에서 감염이 확인되어 전국적으로 분포하고 있음을 확인하였다. BVG는 2016년 보리에서 첫 보고(Zhao 등, 2016) 이후로 2017년 조(Setaria italica)에서도 발생보고(Park 등, 2017a)가 되었다. 따라서 BVG는 신종바이러스로 보고되었으나 이미 국내 전 지역에 정착하고 있는 바이러스로 예상된다. 또한 BVG는 Polerovirus 속에 속하는 바이러스로 이 속에 속하는 바이러스들은 복숭아혹진딧물(Myzus persicae), 보리수염진딧물(Sitobion avenae) 등의 진딧물에 의해 순환형 영속전염(circulative persistent non-propagative manner)을 통해 전염되는 것으로 보고되어 있다(Yang 등, 2008). 복숭아혹진딧물은 기주범위가 매우 넓지만 주로 과수나 채소작물을 가해하기 때문에 기장의 경우 곡류에 많이 발생하는 보리수염진딧물이 BVG의 주요 전염원인 것으로 생각된다.

본 연구에서는 기장과 수수에 발생하는 바이러스병의 종류와 분포를 알아보기 위하여 전국적인 조사를 실시하였으며 기보고된 바이러스 이외에 미보고 바이러스(수수-RBSDV, 기장-RBSDV) 및 신종(기장-PDMV)으로 의심되는 바이러스를 동정하였다. 이 바이러스들은 주로 애멸구나 진딧물을 통해 전염되기 때문에 농가에서는 매개충 방제와 함께 월동 잡초 제거 등을 통한 지속적인 관리가 필요할 것으로 보인다. 또한 이상증상을 나타내는 많은 시료에서 바이러스가 검출되지 않아 바이러스뿐만 아니라 다른 병해충에 대한 추가적인 실험이 필요할 것으로 생각된다. 본 연구결과를 통해 바이러스병 예방을 위한 저항성 품종 개발 등의 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 사 료되며 동정한 바이러스의 전염 경로 및 매개충, 특징 등에 대한 추가 연구와 지속적인 발생조사가 필요하다.