오이모자이크바이러스 2b 유전자 발현 담배의 형태 및 전사체 분석

Phenotypic and Transcriptomic Analysis of Nicotiana benthamiana Expressing Cucumber mosaic virus 2b gene

Article information

Res. Plant Dis. 2015;21(3):186-192
Publication date (electronic) : 2015 September 30
doi : https://doi.org/10.5423/RPD.2015.21.3.186
손성한1,, 김윤희1, 안율균2, 김도선2, 원소윤1, 김정선1, 최홍수1
1 농촌진흥청 국립농업과학원
1 National Academy of Agricultural Science, Rural Development Administration, Wanju 565-851, Korea
2 농촌진흥청 국립원예특작과학원
2 National Institute of Horticultural & Herbal Science, Rural Development Administration, Wanju 565-852, Korea
*Corresponding author Tel : +82-63-238-4551 Fax: +82-63-238-4509 E-mail: sohnseonghan@korea.kr
Received 2015 June 22; Revised 2015 July 14; Accepted 2015 July 23.

Abstract

요약

오이모자이크바이러스 2b 유전자는 전사후유전자침묵(PTGS)을 억제하는 기능을 가진 억제인자이다. 식물체내 2b 유전자 기능을 분석하기 위해 Nicotiana benthamiana에 형질전환하였고 형태변화와 유전자 발현변화를 분석하였다. 8계통의 2b 유전자 형질전환체 중에서 1개의 유전자가 T0 개체에 삽입된 계통은 3개였다. 2b 유전자 형질전환체는 일반적으로 종자 확보가 어려웠지만 다행히 일부 배수화되지 않은 계통(hemizygote)에서는 소량의 종자가 확보되어 계통유지가 가능하였다. 고정계통의 전사체를 해독하여 대조와 비교분석한 바, 2b 유전자는 특정유전자의 발현을 선택적으로 증대시키는 것이 아닌 다수의 유전자를 비선택적으로 발현을 증대시키는 것으로 판단되었다. 이러한 결과는 2b 유전자가 세포질에 존재하는 다양한 RNA의 대사중 분해를 억제하여 세포질내 RNA가 축적되고 이로 인해 단백질 합성도 증대되어 정상적 생장발달이 저해되고 기형적인 형태의 식물체가 되는 요인으로 판단된다.

Trans Abstract

Cucumber mosaic virus possesses 2b gene known as a suppressor of post-transcriptional gene silencing (PTGS). To investigate its function and effect in plant, transgenic Nicotiana benethamiana expressing 2b gene was developed and analyzed in phenotypic characteristics and differential gene expression (DEG) comparing with wild-type. Eight lines of transgenic plants (T0) were obtained with difficulty and showed severe deformed phenotypes in leaves, flowers, petioles and etc. Moreover, transgenic plants were hardly able to set seeds, but small amounts of seeds were barely produced in some of transgene-hemizygous plants. DEG analysis showed that transgenic plant ectopically accumulated diverse RNA transcripts at higher levels than wild-type probably due to the disturbance in RNA metabolism, especially of RNA decay, caused by 2b-mediated inhibition of PTGS. These ectopic accumulations of RNAs disrupt protein and RNA homeostasis and then subsequently lead to abnormal phenotypes of transgenic plants.

서론

바이러스와 식물체는 공격과 방어의 연속적 상호작용을 통해 진화해 왔으며 식물체는 바이러스가 침입하면 다양한 조절인자(effectator)와 일련의 신호전달과정에 의해 자체 방어 유전자 발현을 조절하게 된다(Jada 등, 2013). 대표적으로 전사후 유전자침묵 기작(post-transcriptional gene silencing, PTGS)을 활성화시켜 침입한 바이러스를 무력화시키는데 (Muruganantham 등, 2009), 이러한 유전자 침묵기작은 다양한 신호전달이나 유전자 발현조절 네트워크와 밀접하게 연동되어 있는 것으로 판단된다. 즉, 바이러스가 식물에 침입하면 바이러스게놈을 증식하는 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)가 double-stranded RNA(dsRNA)를 생산한다. 이때 dsRNA를 Dicer(DCL) 단백질이 인식하여 21-25 nucleotide(nt)의 small-interfering RNA(siRNA)로 잘라내고, siRNA는 식물의 RNA 유도침묵복합체(RNA-induced silencing complex, RISC)와 결합하여 siRNA와 염기서열과 상보적인 서열을 보유한 RNA, 즉 바이러스의 RNA를 선택적으로 절단하면서 저항성을 발현하게 되며 이렇게 RNA를 절단하여 유전자발현을 억제하는 작용을 RNA 침묵(silencing)이라 하며 식물에서의 RNA 침묵 기작은 바이러스 침입에 대한 방어수단으로 사용될 뿐만 아니라 식물의 유전자의 발현을 좀 더 정교하게 조절함으로써 식물의 발달, 생리, 스트레스 저항성 등에도 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한 불완전한 머리핀 형성 RNA(imperfect hairpin-forming RNA)를 Dicer가 절단하여 21nt의 microRNA(miRNA)가 생산되고, 이렇게 만들어진 miRNA는 목표 RNA를 절단하거나 단백질 합성을 저해함으로써 유전자의 발현을 억제한다(Eamens 등, 2008; Frizzi와 Huang, 2010). 한편 바이러스도 식물의 저항성 기작에 대응하기 위해서 유전자침묵 억제인자(suppressor)를 보유하기도 한다. 특히 감자바이러스 X(Potato virus X, PVX)의 p25 유전자, HC-Pro 유전자(helper component-proteinase), 오이모자이크바이러스(CMV) 2b 유전자 및 Tomato bushy stunt virus(TBSV)의 p19 유전자 등이 RNA 침묵을 억제하는 것으로 알려져 있다(Roth 등, 2004). p19 단백질은 siRNA와 RISC가 결합하는 것을 방해하여 RNA가 절단되지 못하게 하여 유전자침묵을 억제하고(Vargason 등, 2003; Ye 등, 2003), HC-Pro 단백질은 siRNA가 축적되는 것을 억제하는 것으로 알려져 있는데(Llave 등, 2000; Mallory 등, 2001), 그 기작은 siRNA 또는 miRNA의 이중나선(duplex) 단편이 풀려지지 못하게 하여 RISC에 결합을 못해 RNA 침묵이 억제되는 것으로 알려지고 있다(Dunoyer 등, 2005). 오이모자이크바이러스는 3개의 단일나선 RNA 게놈(RNA 1, 2, 3)으로 구성되어 있다. RNA2 게놈에 있는 2b 유전자는 억제인자(suppressor)로서 전사후유전자침묵을 억제하는 것으로 발견되었다(Ding 등, 1994). 2b 유전자는 RISC에 의한 RNA 절단기능을 방해하고 또한 핵내에서 전사인자에 영향을 끼쳐 전사후유전자침묵을 억제하는 것으로 추정하고 있지만(Goto 등, 2007; Zhang 등, 2006), 정확한 기능은 지속적으로 밝히고 있는 상황이다. 2b 단백질은 오이모자이크바이러스 RNA 게놈과 위성RNA(satellite RNA)를 증식하는데 필수적인 인자로 확인되기도 하였다(Ding 등, 1995). 최근 실험적으로는 agroinfiltration에 의한 외래유전자를 잎에서 일시발현시킬 때, 2b 유전자도 같이 발현시키면 외래단백질의 발현량이 증대되고 발현기간도 연장되는 결과도 확인되기도 하였다(Choi 등, 2008; Sohn 등, 2011a). 2b 유전자에 의해 외래유전자가 활발히 발현하는 기간에는 잎의 생장이 억제되었지만 발현이 감소되면 억제되었던 잎의 생장이 회복되는 현상도 확인하였다. 이는 2b 유전자의 발현이 식물의 생장과 발달을 저해할 수 있다는 가능성을 암시하는 것이다.

따라서 본 연구에서는 오이모자이크바이러스 2b 유전자를 담배(Nicotiana benthamiana)에 형질전환하고 2b 유전자가 안정적으로 발현하는 형질전환체를 선발하고 표현형질을 분석하여 2b 유전자의 영향을 분석하고자 하였다. 특히 형질전환체와 대조식물에서 전사되는 RNA를 차세대유전체염기서열기술로 해독하여 유전자 발현차이를 분석하여 형태적 변이의 요인을 추적하고자 하였다.

재료 및 방법

2b 유전자 발현 형질전환체 생산

오이모자이크바이러스 2b 유전자의 담배(N. benthamiana) 형질전환은 pGreen0229-35S:2b(35S-2b) (Choi 등, 2008) 운반체를 보유한 Agrobacterium tumefaciens AGL1을 담배 잎절편에 형질전환하고 재분화하는 방법을 통해 생산하였다(Choi 등, 2008; Sohn 등, 2011b). 2b 유전자가 삽입된 형질전환체를 선발하기 위해서는 pGreen0229-35S:2b 운반체내 T-DNA 부위에 함께 존재하는 제초제저항성 유전자(nos-bar)를 선발마커로 사용하여 바스타(Basta®, 몬산토, 미국)를 살포하고 저항성이 뚜렷한 개체를 형질전환체로 선발하였다(Sohn 등, 2011b). 2b 유전자의 기능을 확인하기 위해 T0 세대에서 한 개의 2b 유전자만 삽입된 계통을 우선적으로 선발하고 후대육성 과정에서 배수화되어 유전적으로 고정되고 표현형이 안정된 계통을 확보하였다. 이때 후대육성에 따른 계통번호는 2b-T0-T1-T2와 같이 부여하였다.

2b 유전자 삽입 및 발현분석

pGreen0229-35S:2b의 TDNA 부위에는 35S 프로모터와 2b 유전자 사이에 한 곳의 HindIII 제한효소 절단위치가 있어 형질전환체 핵 DNA를 HindIII로 절단하고 Southern blot을 하면 2b 유전자의 삽입갯수를 확인할 수 있다. 핵 DNA는 DNeasy® Plant Mini Kit(Qiagen, 독일)를 사용하여 잎조직에서 추출하였으며, 2b 유전자의 발현을 확인하기 위한 RNA는 Trizol® regent(Invitrogen, 미국)로 분리하였다. 2b 유전자 특이 프로브를 사용한 Southern과 Northern의 자세한 방법 및 절차는 Choi 등(2008)의 방법을 준용하였다. 2b 유전자의 배수화를 확인하기 위해 RuBisCO Small subunit(RbcS) 유전자를 기준으로 duplex PCR을 수행하였다. 2b 유전자 프라이머(5’-tcatcgaaaggacagtagaaaag-3’,5’-gcgaaaccctataagaaccctaat-3’)와 RbcS 프라이머(5’-tactatgatggcagatactggaccatgtggaag-3’,5’-ttagtagccttctggcttgtaggcgatgaaact-3’)를 함께 PCR master mix(Bioneer, K-2055, 한국)에 넣고 94°C에서 5분 1회, 96°C/10초 - 55°C/30초 - 72°C/1분을 35회 반복한 후 전기 영동하여 RbcS 유전자 밴드 강도를 기준으로 하여 상대적인 2b 유전자 밴드를 확인하여 배수화를 확인하였다.

형질전환체 전사체분석

2b 유전자 발현에 의한 형질전환체(2b-1-29-3)내에 유전자 발현차이를 전체적으로 분석하기 위해 대조식물체와 함께 잎에서 총 RNA를 3반복으로 분리하여 대량 단거리 염기서열(HiSeq 2000, Illumina, 미국)로 해독하였다. 형질전환체와 대조식물체의 단거리 염기서열(pairedend, 101 bp) 총 갯수는 각각 202,646,458와 202,462,416개가 생산되었으며(NABIC 등록번호 : NN-1866-1873, NN-0600, nabic.rda.go.kr) 이들을 N. benthamiana 전사체 컨티그(CBMM010000001, EMBL; Sohn 등, 2014)에 CLC Genomics Workbench(CLC Bio, ver. 5.1.5, 덴마크)로 맵핑하였다. 컨티그별 산출된 RPKM(reads per kilo base per million mapped reads) 값을 DESeq package R-3.0.2(R Core Team, 2013)로 분석하여 두 식물체간 발현 전사체의 발현특이성을 분석하였다. 이 때 두 식물체간 발현량이 3배 이상 차이나는 컨티그를 추출하여 BLAST2GO 분석(Conesa 등, 2005)과 MapMan(Ver. 3.6.0 RC1; Thimm 등, 2004; mapman.gabipd.org)으로 분석하여 2b 유전자에 의한 유전자 발현변화를 해석하고자 하였다.

결과 및 고찰

형질전환체 선발 및 형태적 변화

도입유전자가 배수화되어 표현형질이 안정된 T2 개체를 확보하기 위하여 T0부터 T2 세대까지 제초제를 살포하여 저항성 개체를 계속적으로 선발하였다. 일반적으로 T0 세대의 형질전환체는 도입유전자의 삽입 갯수, 위치 및 발현이 안정적이지 않기 때문에 T1-T2 세대에서 도입유전자가 배수화된 개체(homozygote)를 선발하고자 하였다. 즉, T1 세대의 개체군에 제초제를 살포하여 저항성과 감수성 개체의 분리비가 3:1이면 T0 세대에 삽입된 유전자가 1개이며 이들 T1 세대 개체별 후대 개체군(T2)에 제초제를 살포하여 저항성과 감수성이 더 이상 분리되지 않으면 해당 T1 개체는 도입유전자 배수화된 고정계통으로 이론적으로 선발이 가능하다. 그러나 실제적으로는 대부분의 형질전환체의 꽃이 일찍 시들고 떨어져서 종자확보가 어려워 배수화된 고정계통 유지는 사실상 불가능 하였다. 다행히 일부 도입유전자가 배수화 되지 않은 개체(hemizygote) 중에서 소량의 종자가 생육후기에 결실되기도 하여 형질전환 계통은 유지할 수 있었다. 이는 2b 유전자가 발현되는 개체에서는 생장발달이 심각하게 저해될 수 있다는 것을 보여주고 있으며 특히 배수화된 개체에서는 저해효과가 더 높은 것으로 추정된다. 조직배양시에 형질전환체 재분화가 어려웠던 것도 이러한 생장발달 저해효과와 관계되어 있는 것으로 보인다. 즉, 동일한 형질전환운반체에 2b 유전자 대신 GFP 유전자로 변경된 경우에는 142계통의 형질전환개체(T0)를 생산하였지만(Sohn 등, 2011b) 2b 유전자의 경우에는 8계통만 얻을 수 있었다. 이는 조직배양에 의한 식물체 재분화 단계에서도 2b 유전자가 정상적인 분화를저해한 요인으로 추정된다. T0 후대(T1 세대 개체군)에 제초제 저항성을 확인한 결과 8계통중 5 계통은 T0에서 2개 이상의 유전자가 삽입되었고 1개의 유전자가 삽입된 T0 계통은 3개(2b-1, 2b-2, 2b-11)로 나타났다(Table 1).

The phenotypic segregation of T1 progeny plants derived from 8 different transgenic lines

표현형 관찰은 T0 세대 형질전환체(2b-1)에서 T1 세대(2b-1-2와 2b-1-29)를 거쳐 후대분리된 T2 개체와 대조를 비교분석하였다. 영양생장 단계에서는 대조에 비해 작은 잎, 거친 잎 표면, 길어진 잎병, 짧아진 줄기마디, 낮아진 초장 등 생장이 억제되고 기형적인 형태가 특징적 이었다(Fig. 1AB). 잎이 확장될 때에 는 공통적으로 잎의 가장자리의 생장이 억제되어 가운데가 볼록하게 튀어나오는 형태였고 도입유전자가 배수화되지 않은 개체(2b-1-2-23)는 배수화 고정된 개체(2b-1-29-3, Fig. 1CE)와 대조식물체의 중간정도의 형태를 보였다(Fig. 1D). 개화시기에 서 형태변화를 관찰한 결과(Fig. 2), 형질전환체의 꽃받침은 구조적으로 나누어지지 못하고 융합된 형태로 유지되었으며(Fig. 2B-C), 꽃잎도 형질전환체에서는 완전히 펴지지 않고 접혀있는 형태였다(Fig. 2D-I). 형질전환체의 꽃은 대조식물 보다 일찍 시들어 줄기에서 떨어지는 경우가 일반적 현상이였고(Fig. 2J-K, 적색 화살표), 도입유전자 배수화와 상관없이 꽃의 구조가 불완전하였고, 꽃이 피어도 일찍 시들고 탈락되어 종자를 수확하기 어려웠다. 그러나 일부개체에서는 생육말기에 몇 개의 꽃에서 부실하지만 소량의 종자 얻을 수 있었는데, 이들 개체들은 배수화되지 않은 개체(hemizygote)가 대부분이었다. 따라서 2b 유전자 형질전환체의 후대는 다행히 배수화되지 않은 계통이지만 유지가 가능하였다.

Fig. 1

Phenotypic differences between wild-type (WT) and 2b transgenic plants at the vegetative growth stage. (A) WT. (B) Malformed leaf-shape in 2b transgenic plant (T2, 2b-1-29-2) which is homozygous for 2b gene. The length of petioles and leaf sizes are respectively longer and smaller than those of WT. (C) Typical leaf-shape and development in WT. (D) The curved-edges and bulging leaf-surfaces of 2b-1-2-23 plant (T2, hemizygous). (E) Rolling of the leaf blades into mild cup-shaped form in 2b-1-29-3 plant (T2, homozygous). Most leaves of transgenic plants are not fully straightened out compared to those of WT.

Fig. 2

Differences of flower development and shapes between wild-type (WT) and 2b transgenic plants. (A), (D) and (E) Normal development of flowers in WT. (B) and (C) The abnormal development of sepals in 2b-1-2-23 (T2, hemizygous) and 2b-1-2-4 (T2, homozygous), respectively, in which development of most sepals were interrupted and withered. (F), (H), (G) and (I) The sepal-shapes of mature flowers in 2b-1-29-1 (T2, hemizygous) and 2b-1-29-3 (T2, homozygous). The sepals were usually folded not but fully straightened. (J) The upper-region of stems actively producing flowers in WT. (K) The withered flowers (red-colored arrowheads) in 2b-1-2-1 (T2, hemizygous) which fortunately produced a small amount of seeds for maintenance of 2b transgenic lines, however, homozygous plants hardly produced the seeds.

도입유전자 삽입 및 발현분석

7개의 T2 개체(2b-1-2-n)를 대상으로 Southern, duplex PCR 및 Northern 분석을 실시하여 2b 유전자의 삽입, 배수화 및 발현을 분석하였다(Fig. 3). Southern 분석결과에서는 한 개의 동일한 크기의 밴드가 7개 개체에서 검출되어 T0 개체(2b-1)에 한 개의 2b 유전자가 핵 DNA에 삽입된 것으로 확인되었다. T2 세대 개체중에서 도입유전자가 배수화 되었는지 확인하기 위해 duplex PCR로 확인한 결과 Southern 분석에서도 강한 밴드를 가진 3개체(2b-1-2-4, -5 및 -6, Fig. 3A)가 배수화된 것으로 확인되었고, 나머지 4개체는 배수화되지않은 개체(hemizygote)임이 확인되었다(Fig. 3B). 삽입유전자 발현을 확인하기 위한 Northern 분석은 7개 개체 모두 2b 유전자의 mRNA가 검출되되어 도입된 2b 유전자는 식물형질전환체내에서 정상적으로 발현되는 것으로 확인할 수 있었지만(Fig. 3C) 배수화된 3개의 개체와 배수화되지 않은 개체간의 2bmRNA 발현양 차이를 구분하기는 어려웠다. 생장발달 과정중 나타난 형태적 변이와 2b 유전자의 연관성을 분석하기 위해서 는 형태변이가 더 심한 고정계통(2b-1-29-3)을 대상으로 전사체를 분석하였다.

Fig. 3

Confirmation of the incorporation and expression of 2b gene in T2 progenies derived from 2b-1 (T0). (A) Confirmation of incorporation of a single-copied transgene in 2b-1 by Southern blot analysis. Genomic DNAs were digested with HindIII which restriction site was found at a single position in the T-DNA region. (B) Duplex PCR to discriminate between homozygous and hemizygous plants of transgene compared with the band intensity of an internal standard such as rbcS gene. (C) Northern blot to detect 2b mRNAs in transgenic plants. (D) Total RNA was extracted from transgenic plants and electrophoresed in 1.5% (w/v) formaldehyde agarose gel.

전사체 프로필 변화분석

2b-1-29-3계통과 대조식물의 RNA 단거리 염기서열을 전사체 표준컨티그(CBMM010000001, EMBL; Sohn 등, 2014)에 맵핑하여 형질전환체내의 유전자 발현차이를 분석하였다. 컨티그별 형질전환체와 대조식물간의 발현양 차이를 scatter plot으로 분석한 바(Fig. 4A), 형질전환체는 많은 수의 유전자 발현을 증대시킨 것으로 확인되었다. 형태적 변형에 연관된 유전자를 특정하기 위해 형질전환체와 대조식물간에 3배 이상 발현량 차이를 나타내는 컨티그를 DESeq package로 분석하였다. 이때, FDR(false discovery rate)인 P-value(Benjamini and Hochberg-corrected) ≤0.01로 하였다(Table 2). 형질전환체에서 119개, 대조식물에서는 12개로 추출된 컨티그를 BLASTx(E-value<10-5)와 BlasT2GO로 유전자 기능을 예측한 바, 신호전달, 물질대사, 호르몬, 전사인자 등 다양한 유전자가 혼합되어 형태변이와 연관된 유전자를 특정하기 어려웠다(Table 2). 따라서, 2b 유전자에 의한 다른 유전자의 발현영향을 전체적으로 분석하기 위하여 2배 이상으로 범위를 확대하고 유전자를 추출하여 MapMan(Thimm 등, 2004)으로 분석하였다(Fig. 4B). 그 결과 핵내 DNA 합성 및 수리, RNA 합성 등에 관련된 유전자를 제외한 세포질에서 작용하는 대부분의 생물적기능(예, 단백질 합성·변경·분해, 세포분열, 스트레스, 호르몬, 발달 등)에 해당하는 유전자가 형질전환체내에서 골고루 발현이 증대되었다(Fig. 4B). 이는 2b 유전자가 선택적으로 특정 유전자만을 발현 증대시키는 것이 아니라 비선택적으로 많은 수의 유전자에 대해 발현을 증대시키는 것이라는 증거로 판단된다. 또한, 2b 유전자의 발현에 따른 식물의 생물적/무생물적 스트레스(biotic/abiotic stress, Fig. 4C)에 관련된 유전자의 발현량을 비교한 바(Fig. 4C), 신호전달(signaling), 세포벽(cell wall), 호르몬(auxin), 산화환원반응(redox)에 관련된 유전자가 발현증대 되었지만 전사인자(transcription factor) 및 하위 방어유전자(defense genes)의 발현에는 특이한 차이가 없었다. 즉, 2b 유전자는 직접적으로 병방어 관련 유전자를 발현증대시키지 않는 것으로 보인다. 전사체해독에 의한 유전자 발현차이와 Map-Man 분석에 의하면 2b 유전자는 특정유전자를 선택적으로 발현을 증대시키는 것이 아니라 비선택적으로 많은 유전자의 발현을 증대시키는 것으로 추정된다.

Fig. 4

The scatter plot and MapMan analysis with differentially-expressed genes (DEGs) in 2b transgenic or wild-type plant. (A) A representative scatter plot for DEGs produced from ths analysis by CLC Genomics Workbench (CLC Bio, ver. 5.1.5, Denmark). This plot indicates that 2b gene leads to the over-expression of hundreds of genes in transgenic plant. (B) Biological processes and metabolic pathways analyzed by MapMan (Thimm et al., 2004) with putative over-expressed genes over 3-fold at each plant as in Table 2. This result shows that 2b gene leads to over-expression of genes involved in the most biological processes and metabolic pathways in a nonselective manner. (C) Expressions of biotic and abiotic stress-related genes analyzed by MapMan. The 2b gene leads to over-expression of most genes involved in the stresses.

The putative genes expressed over 3-fold in 2b transgenic plant compared to wild-type and vice versa

2b 유전자 기능 해석

비선택적 발현증대의 요인은 GFP와 2b 유전자를 동시에 담배잎에 agroinfiltration하여 GFP 발현결과(Choi 등, 2008)에서 실마리를 찾을 수 있다. 담배 잎에 서 GFP 유전자만 단독으로 일시발현시키는 경우보다 2b 유전자와 함께 발현시키면 GFP 유전자의 발현강도와 기간이 증대되었다. 즉, 2b 단백질이 없는 경우에는 3일 정도까지만 GFP mRNA가 검출되는데 반하여 2b 단백질이 존재하면 7일까지 뚜렷히 검출되었다. 이는 2b 단백질이 식물의 유전자침묵 기작중 하나인 RNA 침묵을 억제하여(Goto 등, 2007; Zhang 등, 2006), GFP mRNA가 세포질에 과도하게 축적되어 mRNA 양도 높아지고 비례해서 GFP 단백질양도 많이 축적되는 것으로 추정된다. 즉, 이러한 2b 단백질의 RNA 침묵 억제기능은 세포질에 있는 모든 RNA에게도 적용되는 것으로 판단된다. 일반적으로 RNA 대사는 전사된 RNA가 최종적으로 분해되면서 식물의 정상적인 생장, 분화, 발달을 조절하는 것으로 알려지고 있으며(Jung 등, 2013), 이때 RNA의 분해와 발현조절에 관련되는 siRNA나 miRNA의 기능을 2b 유전자에 의해 억제되어 식물의 RNA 대사가 전체적으로 혼란에 빠지는 것으로 판단된다. 이는 다양한 종류의 RNA가 비정상적으로 축적되어 식물형태 발달을 변형시키는 요인으로 판단된다.

Acknowledgement

This research was partially funded by both National Agricultural Genome Program (NAGP, PJ010449) and National Academy of Agricultural Science (NAAS, PJ008673) of Rural Development Administration (RDA), the Republic of Korea.

References

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Table 1

The phenotypic segregation of T1 progeny plants derived from 8 different transgenic lines

Transgenic line (T0)a Segregation of herbicide (Basta®) resistance (T1)b Expected No. transgenec

No. resistant No. susceptible Segregation ratio
2b-1 23 6 3:1 1
2b-2 26 6 3:1 1
2b-4 32 0 - >2
2b-5 31 1 - >2
2b-6 31 1 - >2
2b-8 30 2 - >2
2b-9 32 0 - >1
2b-11 23 9 3:1 1
a

The pedigree number of T0 plants.

b

The number of plants classified by herbicide resistance and susceptibility.

c

The expected number of transgene inserted in T0 plant.

Fig. 1

Phenotypic differences between wild-type (WT) and 2b transgenic plants at the vegetative growth stage. (A) WT. (B) Malformed leaf-shape in 2b transgenic plant (T2, 2b-1-29-2) which is homozygous for 2b gene. The length of petioles and leaf sizes are respectively longer and smaller than those of WT. (C) Typical leaf-shape and development in WT. (D) The curved-edges and bulging leaf-surfaces of 2b-1-2-23 plant (T2, hemizygous). (E) Rolling of the leaf blades into mild cup-shaped form in 2b-1-29-3 plant (T2, homozygous). Most leaves of transgenic plants are not fully straightened out compared to those of WT.

Fig. 2

Differences of flower development and shapes between wild-type (WT) and 2b transgenic plants. (A), (D) and (E) Normal development of flowers in WT. (B) and (C) The abnormal development of sepals in 2b-1-2-23 (T2, hemizygous) and 2b-1-2-4 (T2, homozygous), respectively, in which development of most sepals were interrupted and withered. (F), (H), (G) and (I) The sepal-shapes of mature flowers in 2b-1-29-1 (T2, hemizygous) and 2b-1-29-3 (T2, homozygous). The sepals were usually folded not but fully straightened. (J) The upper-region of stems actively producing flowers in WT. (K) The withered flowers (red-colored arrowheads) in 2b-1-2-1 (T2, hemizygous) which fortunately produced a small amount of seeds for maintenance of 2b transgenic lines, however, homozygous plants hardly produced the seeds.

Fig. 3

Confirmation of the incorporation and expression of 2b gene in T2 progenies derived from 2b-1 (T0). (A) Confirmation of incorporation of a single-copied transgene in 2b-1 by Southern blot analysis. Genomic DNAs were digested with HindIII which restriction site was found at a single position in the T-DNA region. (B) Duplex PCR to discriminate between homozygous and hemizygous plants of transgene compared with the band intensity of an internal standard such as rbcS gene. (C) Northern blot to detect 2b mRNAs in transgenic plants. (D) Total RNA was extracted from transgenic plants and electrophoresed in 1.5% (w/v) formaldehyde agarose gel.

Fig. 4

The scatter plot and MapMan analysis with differentially-expressed genes (DEGs) in 2b transgenic or wild-type plant. (A) A representative scatter plot for DEGs produced from ths analysis by CLC Genomics Workbench (CLC Bio, ver. 5.1.5, Denmark). This plot indicates that 2b gene leads to the over-expression of hundreds of genes in transgenic plant. (B) Biological processes and metabolic pathways analyzed by MapMan (Thimm et al., 2004) with putative over-expressed genes over 3-fold at each plant as in Table 2. This result shows that 2b gene leads to over-expression of genes involved in the most biological processes and metabolic pathways in a nonselective manner. (C) Expressions of biotic and abiotic stress-related genes analyzed by MapMan. The 2b gene leads to over-expression of most genes involved in the stresses.

Table 2

The putative genes expressed over 3-fold in 2b transgenic plant compared to wild-type and vice versa

Plant Putative genes No
2b transgenic plant calmodulin, calcium-transporting ATPase 2, rapid alkalinization factor, calcium-binding, calcium-dependent protein kinase, arginine decarboxylase, ABA 8’-hydroxylase, jasmonate ZIM domain, Avr9/Cf-9 rapidly elicited, proteinase inhibitor I, cadmium resistance 2-like, snakin-2, glucan endo-1,3-beta-glucosidase 8-like, beta-1,3-glucanase 3, NDR1-like, chaperone ClpD, LEA1-like, pleiotropic drug resistance 1, ABC1, wound-inuduced kinase, zinc finger A20, UDP-glucose dehydrogenase 2, charged multivesicular body 5-like, early nodulin-like 2-like, 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase, bifunctional polymyxin resistance ArnA-like, cellulose synthase, CASP-like, allene oxide cyclase, ethylene response factor, DREB4, vacuolar protein sorting-associated 3, CCR4-associated factor, thioredoxin h-like, syntaxin-related, multifunctional, PS60, receptor-like protein kinase, G-type lectin S-receptor-like, signal recognition particle receptor, nam-like protein 1, NAD-malate dehydrogenase, malate dehydrogenase, protein phosphatase 2C, E3 ubiquitin-protein ligase PUB23-like, putative sterol desaturase, WIZZ, lipoxygenase, erg-1, ALA-interacting subunit 1-like protein translation factor, TOM1-like protein, small GTP-binding, UDP-glucuronate 4-epimerase 6-like, desumoylating isopeptidase 1-like, UDP-glucose:protein transglucosylase-like, remorin 2, 4,5-DOPA dioxygenase extradiol-like, chitin-inducible gibberellin-responsive, Hop-interacting THI039, methyltransferase, RNA-binding glycine rich, nudix hydrolase 17, rapid alkalinization factor, carboxylesterase 13-like, coiled-coil domain-containing109B-like, inorganic pyrophosphatase, 3-ketoacyl-CoA synthase 11-like, RAV, formate—tetrahydrofolate ligase-like, regulator of gene silencing, GPI-anchored, peptide/nitrate transporter 119

Wild-type uncharacterized protein, NADH dehydrogenase subunit 5, photosystem II protein D1, ethylene-responsive transcription factor 5, invertase inhibitor, gamma-glutamyl transpeptidase 3-like, glycine-rich protein2, chalcone synthase 2 12

Putative genes were analysed and annotated by DESeq (P-value ≤0.01), a BLASTx (E-value <10-5) and BlasT2GO. P-value (Benjamini and Hochberg-corrected) was analysed by multiple tests.