Res. Plant Dis > Volume 21(2); 2015 > Article
Meloidogyne incognita에 살선충활성을 보이는 신규 Streptomyces netropsis의 살선충 특성 규명

요약

효과적으로 선충 방제에 사용되던 토양훈증제 methyl bromide와 비훈중제 농약이 환경오염 문제로 인해 사용이 금지됨에 따라 선충의 방제는 어려워지고 있다. 따라서 이를 대체할 수 있는 생물 기반의 살선충제의 개발이 시급히 요구된다. 본 연구는 화학적 농약의 대안으로서 방선균을 이용한 살선충제 개발을 목적으로 2,700개의 토양방선균 배양액의 50% 메탄올 추출액의 뿌리혹선충에 대한 살선충 활성을 스크리닝하였다. AN110065 균주는 배양액 10%에 해당하는 50% 메탄올 추출액 20% 처리 1일 후 78.9%의 치사 활성을 보였으며, 처리 3일 후 94.1%의 살선충 활성을 보였다. 선발 균주의 분자생물학적 동정을 위해 16S rRNA sequencing 분석을 수행한 결과 S. netropsis와 99.78%의 상동성을 보였다. S. netropsis AN110065 배양액을 에틸 아세테이트, 부탄올을 이용하여 용매 분획하여 에틸 아세테이트와 부탄올, 물 추출물에 대한 살선충 활성을 조사한 결과 에틸 아세테이트 추출물의 1,000 µg/ml 농도에서 83.5%로서 가장 우수한 살선충 활성을 보였다. AN110065 배양액의 토마토 작물에 대한 뿌리혹선충병 방제 활성을 조사한 결과 10배 희석액 처리구에서 눈에 띄게 뿌리혹형성을 저해하였다. 이와 같은 결과로 AN110065 균주는 유기농업에서 사용할 수 있는 미생물제제로서의 가능성이 있음을 나타내었다.

ABSTRACT

Control of nematode has become difficult owing to the restricted use of effective soil fumigant, methyl bromide, and other non-fumigant nematicides. Therefore, it is urgently necessary to develop microbial nematicide to replace chemical nematicides. In this study, the 50% aqueous methanol extraction solution of fermentation broths of 2,700 actinomycete strains were tested for their nematicidal activity against second stage of juveniles (J2s) of Meloidogyne incognita. As the results, only the 50% aqueous methanol extraction solution of AN110065, at 20% equivalent to 10% fermentation broth, showed strong nematicidal activity with 78.9% of mortality 24 h after treatment and 94.1% of mortality at 72 h. The 16S rRNA gene sequencing showed that the strain sequence was 99.78% identical to Streptomyces netropsis. The extract of S. netropsis AN110065 fermentation broth was successively partitioned with ethyl acetate and butanol and then the ethyl acetate, butanol and water layers were investigated for their nematicidal activity against the M. incognita. At 1,000 μg/ml, ethyl acetate layer showed the strongest activity of 83.5% of juvenile mortality 72 h after treatment. The pot experiment using the fermentation broth of AN110065 on tomato plant against M. incognita displayed that it evidently suppressed gall formation at a 10-fold diluent treatment. The tomato plants treated with the fermentation broth of S. netropsis AN110065 did not show any phytotoxicity. The results suggest that S. netropsis AN110065 has a potential to serve as microbial nematicide in organic agriculture.

서론

식물기생성 선충에 속하는 뿌리혹선충(Meloidogyne spp.)은 식물 뿌리에 절대기생하며 중요한 농작물에 심각한 피해를 준다. 전 세계적으로 작물 피해의 약 11%가 선충에 의한 것으로 알려져 있으며, 이를 돈으로 환산할 경우 작물의 손실량은 연간 1조 180억 달러에 달한다(McCart, 2009). 국내의 경우 경북 성주군의 시설재배 지대의 약 54%의 포장이 뿌리혹선충에 감염되어 있다고 보고되었다(Cho 등, 2000). 국내에서 발생하는 주요 선충은 3종으로 땅콩뿌리혹선충(M. arenaria), 당근뿌리혹선충(M. hapla), 고구마뿌리혹선충(M. incognita) 등이며, 그중 특히 국내 시설재배지에서 문제가 되고 있는 뿌리혹선충으로 M.incognitaM. arenaria가 있다(Kim, 2001). 경제적으로 중요성이 큰 채소류 작물 중 토마토(Solanum lycopersicum L.)는 재배면적 및 생산량이 크고, 주로 시설재배에 의존하여 연작재배로 인해 뿌리혹선충병 발생이 큰 문제가 되고 있으며, 토마토를 가해하는 선충은 M. incognita가 대부분을 차지한다고 알려져 있다(Hwang 등, 2014; Qiao 등, 2011; Siddiqui와 Futai, 2009).
뿌리혹선충병의 방제에 일반적으로 합성 농약이 사용되었다. 하지만 최근 전 세계적으로 안전한 먹거리에 대한 관심이 높아지고 환경친화적인 방법으로 농업을 유지하기 위한 정책으로 인해 독성이 강한 살선충제의 사용이 엄격해지고 있다. 유럽의 경우 오존층 파괴와 환경오염 문제로 인해 토양훈증제로 주로 사용하는 methyl bromide의 조제 및 사용을 2015년부터 금지할 예정이며(Caboni 등, 2013; Oka 등, 2000), 또한 비훈증제 농약으로 cadusafos는 높은 독성으로 인해 사용이 금지될 예정이다(Qiao 등, 2011). 따라서 이를 대체할 수 있는 환경에 더욱 안전하고 높은 약효를 갖는 살선충제의 개발이 시급히 요구된다. 현재 많은 연구자가 식물과 미생물을 이용한 바이오 살선충제를 개발하기 위하여 연구를 진행하고 있다(Khan 등, 2008; Le Dang 등, 2011; Park 등, 2014; Siddiqui와 Mahmood, 1999; Tian 등, 2007).
토양에 서식하는 선충은 세균이나 다른 균류와의 경쟁을 통해 자극받을 수 있으며 이러한 특성으로 토양미생물을 이용해 선충을 방제할 수 있다. 방선균은 균사체로 증식하는 토양 미생물로 현재까지 알려진 천연 항생물질의 60-70%가 방선균에 의해 생산된다고 보고되어 있다(Berdy, 2005). 특히 Streptomyces 속의 방선균은 살선충 활성을 갖는 2차 대사산물을 생산하여 식물기생선충을 방제할 수 있다. 지금까지 보고된 Streptomyces 속 방선균이 생산하는 살선충 물질은 avermectin, milbemycin, bafilomycin, leucanicidins, geldanamycin, fungichromin B, fervenulin, 3-methoxy-2-methyl-carbazole-1,4-quinone, carbazomycins D와 F, 3-benzyl-1,4-diaza-2, 5-dioxobicyclo[4.3.0] nonane 등이 보고되어 있다(Burg 등, 1979; Lacey 등, 1995; Nonaka 등, 2000; Ruanpanun 등, 2010; Ruanpanun 등, 2011; Skantar 등, 2005; Yoon 등, 2012; Zeng 등, 2013). 하지만 이들 물질을 생산하는 길항 방선균을 직접 이용한 미생물 농약 개발은 전무한 실정이며, 방선균에 의해 생산된 avermectin의 혼합물인 abamectin만이 현재 전 세계적으로 화학농약으로 판매되고 있다. Abamectin의 경우 중국을 제외하고는 대부분의 나라에서는 화학농약으로 취급되기 때문에 친환경 농법에서는 사용할 수 없다. 따라서 뿌리혹선충을 방제하기 위한 길항 방선균의 탐색 및 방선균을 직접적으로 이용한 미생물 살선충제 개발이 절실히 요구된다.
본 연구에서는 방선균의 뿌리혹선충(M. incognita)에 대한 살선충 활성 평가를 통해 우수한 활성을 갖는 균주를 선발 및 동정하였다. 그리고 선발한 균주에 대하여 in vitroin vivo 살선충 활성 검정을 통하여 미생물 살선충제로서의 개발 가능성을 검토하였다.

재료 및 방법

방선균

다양한 지역의 토양에서 분리한 방선균의 배양은 Bennett 한천배지(1% glucose, 0.1% yeast extract, 0.2% Bactopeptone, 0.1% beef extract, 2% agar) (Hesseltine 등, 1954)에 서 고체 배양한 후 균체 조각을 5개씩 넣어 100 ml의 멸균된 GSS 배지(1% soluble starch, 0.025% K2HPO4, 2.5% soybean meal, 0.1% beef extract, 0.4% yeast extract, 0.2% NaCl2 g/l, 2% glucose, 0.2% CaCO3(pH7.2))(Kim 등, 1989)가 들어있는 500 ml baffled 삼각플라스크에서 150 rpm, 28°C 조건으로 7일 동안 진탕 배양하였다.

분리 균주의 형태학적 특성 분석 및 균주 동정

최종 선발한 균주의 형태학적 특성을 조사하기 위해 AN110065 균주는 Bennett 한천배지를 이용하여 28°C 배양기에서 14일 동안 배양하였다. 분리한 균주의 포자 형태와 크기는 주사전자현미경(Scanning electron microphotograph, SEM, JSM-6700F, JEOL Ltd, Japan)을 통해 조사하였다. 관찰을 위한 AN110065 균주 시료는 glutaraldehyde(2.5%, 0.1 M phosphate buffer, pH 7.0)로 고정한 후, 에탄올을 이용하여 탈수하였다. 탈수한 균체를 isoamyl acetate에 담근 다음, 액체 CO2로 isoamyl acetate를 증발시킨 후, 금박을 입혀 전자현미경으로 관찰하였다.
분자 계통학적 분석은 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 이루어졌다. AN110065 균주를 5 ml Bennett’s 액체 배지에서 28°C, 150 rpm 조건으로 3일 동안 진탕 배양하였다. 배양액을 4°C, 13,000 rpm 조건에서 10분 동안 원심분리하여 균체를 얻었다. 침강된 균체로부터 Qiagen 사의 DNeasy Blood & Tissue kit(Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여 DNA를 획득하였다. 16S rRNA 유전자는 universal primer(27F; 5’ -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’, 1492R; 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)를 이용하여 중합 효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다(Lane, 1991). 분리균주의 16S rDNA sequences를 관련된 분류군의 16S rRNA gene sequences와 비교하여 CLUSTAL X software(Thompson 등, 1997)로 분석하였고 분자계통학적 계통수의 작성은 MEGA 프로그램 패키지를 사용하여 수행하였다(Tamura 등, 2013) 분자계통도는 거리행렬법 중의 하나인 Neighbour-joining method (Saitou와 Nei, 1987)를 사용하여 구성하였고 Bootstrap 분석은 1000회 수행하였다.

뿌리혹선충의 증식 및 유충 분리

실험에 사용한 뿌리혹선충은 Hwang 등(2014)이 분리 및 동정한 종으로서 ‘서광’(몬산토코리아) 품종의 토마토를 이용하여 온실(25±5°C)에서 증식하여 실험에 사용하였다. 원예용 상토(쑥쑥이, 농우바이오)와 멸균한 모래를 동량으로 혼합한 토양을 직경 9.5 cm 플라스틱 포트에 넣고, 파종하여 3주 동안 재배한 토마토 유묘를 이식하였다. 일주일 동안 더 재배한 후 뿌리혹선충의 알을 주 당 10,000개씩 접종하였으며, 45일에서 60일 동안 재배하여 토마토 뿌리에 혹이 형성된 것을 접종원으로 사용하였다.
뿌리혹선충이 심하게 감염된 토마토 뿌리를 채취하고, 뿌리에 생긴 혹과 난낭으로부터 뿌리혹선충 유충을 분리하여 실험에 사용하였다. 뿌리혹선충 유충의 분리는 Barker 등(1985) 방법을 개량하여 수행하였는데, 뿌리혹선충에 감염된 토마토 뿌리를 물로 씻은 후 1 cm 크기로 잘라 분쇄기에 넣고 0.5% 차아 염소산나트륨(sodium hypochlorite) 용액을 토마토 뿌리가 잠길 정도로 넣은 다음 60초간 분쇄하였다. 분쇄한 시료는 230 mesh 체를 이용하여 찌꺼기를 거른 다음 550 mesh 체에 알을 수집하였다. 550 mesh 체에 모인 선충 알은 멸균수로 3번 세척하여 남아있는 차아 염소산나트륨 용액을 제거하였으며, Baermann funnel 방법 (Southey, 1986)을 이용하여 선충 유충을 분리하였다.

방선균의 살선충 활성 스크리닝

2,700개의 방선균 배양액 추출물의 살선충 활성 스크리닝은 96-well tissue culture plate(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)에서 수행하였다. 상기와 같이 배양한 방선균 배양액 1 ml을 취해 동일 부피의 메탄올을 넣고 20분 동안 초음파 분쇄 추출하였다. 배양액 추출물은 4°C, 13,000 rpm 조건에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 얻었으며 이를 실험에 사용하였다. 선충(J2 유충) 현탁액을 96-well tissue culture plate의 각 well에 넣은 다음 균주 추출물을 5, 10, 20%를 처리하여 well 당 최종 부피가 50 µl (약 50마리 J2) 되도록 하였다. 무처리 대조구는 멸균수:메탄올(1:1, v/v) 용액을 20% 수준으로 처리하였다. 시료 처리 후 96-well micro plate는 시료가 균일하게 섞이도록 30초 동안 교반하였으며, 선충의 산소결핍과 건조를 방지하기 위하여 상대습도 100%의 플라스틱 통에 넣은 후 25-27°C 배양기에서 보관하였다. 실험은 3 반복을 수행하였으며, 시료 처리 24시간과 72시간 후 광학 도립현미경(Olympus CKX41, Tokyo, Japan) 하에서 곧게 뻗어 움직임이 없는 선충을 죽은 선충으로, 유연한 곡선형으로 움직임이 있는 선충을 살아있는 선충으로 판단하여 Abbott’s formula를 이용하여 살선충율을 조사하였다(Abbott, 1925).
살선충율%=처리구의 치사율-대조구의 치사율/100-대조구의 치사율X100

AN110065 균주 용매 분획의 살선충 활성

방선균 배양액의 용매 분획에 따른 살선충 활성 검정을 위해 AN110065 균주를 GSS 배지에서 28°C, 150 rpm 조건에서 10일 동안 진탕 배양하였다. 배양 후 배양액 500 ml에 동량의 메탄올을 더한 후 초음파 분쇄하였으며, 이를 원심분리하여 상등액은 Whatman No 1. 여과지를 이용하여 감압 여과하였다. 여과액은 물이 남을 때까지 50°C에서 감압 농축(EYELA, Japan) 한 후, 동량의 에틸 아세테이트와 부탄올을 이용하여 순차적으로 용매 분획하였다. 용매 분획을 통해 에틸 아세테이트, 부탄올, 물 추출물을 얻어 감압 농축하였으며, 에틸 아세테이트 추출물은 아세톤, 부탄올 추출물은 메탄올, 그리고 물층은 물로 용해하여 최종처리 농도보다 20배 높은 수준으로 stock solution을 조제하였다. 96-well tissue culture plate에 뿌리혹선충(M. incognita) 2령 유충(약 50마리/47.5 µl)을 치상 한 후 각각의 시료를 5% 처리하여 최종 농도가 100, 1,000 µg/ml가 되도록 처리하였다. 무처리 대조구로 5% 메탄올과 아세톤을 사용하였다. 실험은 3반복을 수행하였으며, 시료 처리 24시간과 72시간 후 위에서 설명한 식을 이용하여 살선충 활성을 조사하였다.

토마토 포트에서 뿌리혹선충병 방제 활성 검정

AN110065 균주 배양액을 이용하여 토마토 뿌리혹선충병에 대한 포트 실험을 수행하였다. 뿌리혹선충 포트 실험은 한국화학연구원 5 연구동 내에 있는 유리온실(25±3°C)에서 실시하였다. 직경 9.5 cm 크기의 플라스틱 포트에 멸균한 모래 400 g을 담고 상토에 파종하여 온실에서 2주 동안 생육한 서광 토마토를 이식하였다. 앞서 설명했던 방법으로 뿌리혹선충에 감염된 토마토뿌리로부터 알을 수거하여 각 포트당 10,000 마리를 알을 접종하였다. 그런 다음 GSS 배지에서 28°C, 150 rpm에서 10일 동안 진탕 배양한 AN110065 배양액을 멸균수를 이용하여 10, 100, 1,000배로 희석하여 토마토 뿌리 주변에 일주일 간격으로 4회 토양관주 처리하였다. 대조구로 선충탄(a. i. Fosthiazate 5%) 2,000배 희석액을 1회 처리하였으며, 무처리구로 멸균수를 처리하였다. 실험은 5반복을 수행하였으며, 선충 알 접종 6주 후 식물체의 뿌리를 수돗물로 깨끗이 씻은 후 Taylor와 Sasser (1978) 방법에 따라 뿌리혹 지수를 조사하였다. 토마토 뿌리에 혹이 형성된 정도에 따라 0-5의 지수를 사용하여 6 단계로 조사하였다(0, 0%; 1, 1-20%; 2, 21-40%, 3, 41-60%, 4, 61-80%, 5, 81-100%).

통계분석

통계분석은 SAS(SAS Institute, Inc, 1989, Cary, NC) 프로그램을 이용하여 일원 배치(one-way analysis of variance) ANOVA 분석하였으며, Duncan’s multiple range test(P = 0.05)를 이용하여 유의성 검정을 수행하였다.

결과

스크리닝을 통해 선발된 방선균의 살선충 활성

2,700개의 방선균 배양액 메탄올 추출물중에 단 한 개 균주(AN11006)추출물만이 고구마뿌리혹선충에 대해 높은 살선충 활성을 보였다. AN110065 균주는 배양액 추출액 10% 처리 시 24시간 후 68.3%, 20% 처리 시 78.9%의 살선충율을 보였으며, 5% 처리구에서는 거의 활성을 나타내지 않았다(Fig. 1). 또한, 시료 처리 72시간 후 10% 처리 시 73.2%의 활성을 나타냈으며, 20% 처리 시 94.2%의 살선충 활성을 보여 처리시간이 경과함에 따라 살선충 활성이 유의성 있게 증가하였다(Fig. 1). 하지만 AN110065 균주의 배양여액만을 처리했을 때는 활성을 보이지 않았다. 무처리 대조구로 멸균수:메탄올(1:1, v/v) 용액만을 20% 처리 했을 때 치사활성은 없었다.
Fig. 1
Nematicidal activity of the methanol extract of AN110065 against Meloidogyne incognita. Each value represents the mean ± standard deviation of three replicates. Bars indicate significant differ-ences at 5% probability level.
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AN110065 균주의 형태학적 특성 및 16S rRNA sequencing 분석

AN110065 균주는 흰색의 포자를 형성하였으며, 주사전자현미경으로 관찰한 결과 rectiflexible 한 포자체인 형태를 보이고 원통형 모양의 0.4-1.2 µm 크기의 포자를 형성하였다(Fig. 2AB).
Fig. 2
Culture plate image (A) and scanning electron micrograph (B) of spore surface and hyphae (Bar = 10 µm) of AN110065 on Bennett’s agar at 28°C for 14 days. Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences showing the relationship between strain AN110065 and 10 species of the genus Streptomyces. Numbers at nodes indicate levels of bootstrap support (%) based on analysis of 1000 resampled datasets; only values above 50% are given. NCBI accession numbers for each sequence are in parentheses. Bar, 2 substitution per 1000 nt.
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16S rRNA 유전자 염기서열에 기초한 분자 계통학적 분석 결과, AN110065 균주는 Streptomyces netropsis NBRC 3723과 99.78% 유사도(EZ-taxon blasting 결과)를 보였다(Fig. 2C). 이에 상기에서 분리된 균주를 Streptomyces netropsis AN110065라 명명하였으며, 2013년 09월 23일 자로 국제 기탁기관에 기탁하여 KCTC12490BP라는 기탁 번호를 부여받았다.

용매 분획별 살선충 활성

AN110065 배양액의 메탄올 추출액의 에틸 아세테이트 추출물이 1,000 µg/ml 농도에서 83.5% 수준으로 가장 높은 살선충 활성을 나타내었다(Fig. 3). 부탄올 추출물의 경우 1,000 µg/ml 농도에서 살선충 활성을 보이지 않았으며, 물 추출물의 경우 약 23.4%의 낮은 살선충 활성을 보였다(Fig. 3).
Fig. 3
Nematicidal activities of two organic layers and aqueous layer obtained from the methanol extract of Streptomyces netropsis AN110065 fermentation broth against second-stage juveniles of Meloidogyne incognita. The mortalities were measured 72 h after treatment. Each value represents the mean ± standard deviation of three replicates. Bars indicate significant differences at 5% probability level.
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균주 배양액의 뿌리혹선충에 대한 포트 실험

AN110065 배양액의 10배, 100배, 1,000배 희석액 처리구에서 각각 2.4 2.8, 3.2의 뿌리혹형성지수를 보였으며, 무처리구에서는 4.0의 뿌리혹형성 지수를 보여 무처리구에 비해 농도 의존적으로 뿌리혹형성을 저해하였다(Fig. 4). 또한, AN110065 배양액 10배 희석액은 무처리구와 유의적으로 차이를 보였으나, 100배와 1,000배 희석액은 유의적인 차이가 없었다(Fig. 4). 대조구로 사용한 선충탄은 0.2의 뿌리혹형성지수를 보여 우수한 뿌리혹 형성 저해 활성을 보였다(Fig. 4). 모든 처리구에서 약해는 발견되지 않았다(데이타 미제시).
Fig. 4
Inhibition activity of the fermentation broth of Streptomyces netropsis AN110065 on the gall formation on tomato plant roots caused by Meloidogyne incognita (A) and the treated plants at 6 weeks after infection of root-knot nematodes (B). Gall index: 0 = 0-10%, 1 = 11-20%, 2 = 21-50%, 3 = 51-80%, 4 = 81-90%, and 5 = 91-100% of roots galled (Taylor and Sasser, 1978). Values are mean ± SD of five replicates and means were separated by Duncan’s multiple range test (P = 0.05).
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고찰

토마토는 경제적으로 가장 중요한 작물로서 토마토 작물의 뿌리혹선충에 의한 피해는 인도의 경우 40-46%의 수확량 감소를 일으킨다고 보고된 바 있으며, 중국의 경우 우리나라와 마찬가지로 뿌리혹선충(M. incognita)에 의해 토마토 뿌리혹선충병이 발생하며 중요한 병중 하나라고 보고되었다(Qiao 등, 2011). 본 연구에서 S. netropsis AN110065 발효 배양액 10배 희석액을 토양 관주 처리하였을 때, 토마토 뿌리혹선충병이 40% 방제되는 것을 확인하였으며, 식물 독성은 발견되지 않았다. Wei 등 (2014)Bacillus subtilis jdm2 균주 배양액(109 cfu/ml)을 처리하였을 때 39% 방제 활성을 보였으며, 식물의 생장 또한 왕성했다고 보고하였으며, Kim 등(2011)Streptomyces samposonii KK1024 배양액을 토양에 처리했을 때 농약에 비해서는 낮지만, 무처리구에 비해 난낭의 수가 감소하고, 식물의 생장이 증가했다고 보고하였다.
Kim 등(2011)에 의하면 S. sampsonii KK1024 균주의 배양액 10%에서는 21%, 배양액 20%는 47%의 유충 치사 활성을 보여 배양액 농도가 증가함에 따라 살충율이 증가하였고, Wei 등 (2014)에 의하면 근권미생물 B. subtilis jdm2 균주의 배양여액을 67% 처리하였을 때 시료 처리 24시간 후 64%의 살선충 활성을 보였으며 72시간 후 77%의 유충 치사 활성을 보여 시간이 지남에 따라 더욱 우수한 살충율을 나타내었다. 이들이 발표한 결과는 본 실험의 연구결과와 유사한 결과를 보여주었다.
S. netropsis AN110065 균주의 경우 배양여액만을 처리했을 때 살선충 활성을 보이지 않았다. 토마토를 이용한 포트실험 결과 AN110065 균주 배양액 희석액에서 무처리구에 비해 뿌리혹형성을 저해하였는데, 이는 cell내에 존재하는 살선충 활성물질이 cell의 파괴로 인해 외부로 노출됨에 따라 뿌리혹 형성을 저해한 것으로 추정하였다. Kakar 등(2014)에 의하면 in vivo 벼 갈조병(bacterial brown stripe) 방제 실험에서 Brevibacillus laterosporus B4 배양액 현탁액을 처리하였을 때 병을 저해하였는데 이는 cell내에 존재하는 세포 내 물질(intracellular substance)이 새어나온 결과라고 제시하였다. 본 연구팀에서 avermectin을 생산하는 Streptomyces avermiltiles KCTC 9698 균주를 분양받아 동일하게 실험을 수행한 결과, 배양액 10배 희석액 처리구에서 뿌리혹형성을 약 75% 저해하였다. 또한 in vitro 실험결과 배양여액만을 처리했을 때는 전혀 살선충 활성을 보이지 않았지만, 균체 추출물에서 강력한 살선충 활성을 보였다(데이타 미제시).
방선균은 다양한 생리활성물질을 생산하는 주요한 생산자로 알려졌으며, 이러한 물질은 세포 내 물질(intracellular substance)과 세포 외 물질(extracellular substrance)로 나눌 수 있다. 현재까지 보고된 방선균에 의해 생산되는 살선충 물질은 대부분 세포 내 물질로서 avermectins, bafilomycin, lecanicidins, 3-methoxy-2-methyl-carbazole-1,4-quinone, carbazomycins D와 F 및 fervenulin 등이 보고되어 있다(Burg 등, 1979; Lacey 등, 1995; Nonaka 등, 2000; Ruanpanun 등, 2010; Ruanpanun 등, 2011). S. netropsis AN110065 균주와 같이 활성 물질이 세포 내 물질의 경우 미생물 농약을 개발하는데 균체에 물질이 포함되어 있기 때문에 균체의 수확 및 제제시 거의 물질의 손실이 없다는 장점이 있다. 이에 따라 고활성을 보이는 미생물 살선충제 개발이 가능해진다.
본 연구에서는 방선균 균주 중 가장 살선충 활성이 우수한 S. netropsis AN110065 균주를 선발하였고, 본 균주의 살선충 활성 물질은 균체 내에 함유한 세포 내 물질로 확인되었다. 또한 토마토 작물을 이용한 온실 시험에서도 고구마뿌리혹선충(M. incognita)에 대하여 방제 활성을 보였다. 본 균주를 이용하여 미생물 살선충제를 개발하기 위해서는 균주 개량을 통한 살충 활성 물질 생산능 증대, 최적 발효 공정, 살선충 활성 물질 분리및 구조 동정, 최적의 약효를 위한 제제 개발 및 포장시험 등의 추가적인 연구가 필요하다.

Acknowledgement

This study was performed with support from the Cooperative Research Program for Agricultural Science and Technology Development (Project PJ01020702), Rural Development Administration, Republic of Korea. This research was supported by a grant (10045326) from the R&D Program of MOTIE/KEIT of Republic Korea.

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